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CRISPR/Cas9 - Punktmutationen - Alzheimer - Verifikation

Falscher Buchstabe im Erbgut? Das war bisher fatal!
Punktmutationen sind Ursache vieler Erbkrankheiten und gelten als Risikofaktoren beispielsweise für Alzheimer. 

Eine der Hauptursachen für viele erbliche Krankheiten ließ sich bis Mitte 2016 selbst mit dem „Superwerkzeug“ CRISPR/Cas9 nicht präzise genug beseitigen: die Punktmutation. Setzte man dafür die Genschere ein, kam es häufig zu zufälligen Einfügungen oder dem Wegfall ganzer DNA-Sequenzen. Diese als "indels" bezeichneten Fehler treten auf, weil das Schneiden des DNA-Doppelstrangs zelleigene Reparaturmechanismen aktiviert, die dann diese Fehler verursachen.
David Liu und seine Kollegen von der Harvard University in Cambridge haben jedoch CRISPR/Cas9 so modifiziert, dass die Genschere die DNA nicht mehr schneidet. Dadurch entfällt das Problem der unerwünschten Indels. Stattdessen kann die Genschere nun mit Hilfe angehängter Enzyme direkt im DNA-Strang eine Base in eine andere umwandeln – und so die Punktmutationen korrigieren bzw. gezielt setzen.
Auf diesem Weg ist es gelungen, mittels CRISPR/Cas9 erstmals eine solche Punktmutation im Alzheimer-Risikogen APOE4 zu korrigieren, wie sie im Fachmagazin "Nature" berichten.

Das Beispiel zeigt, dass mit CRISPR/Cas9 offensichtlich ein Werkzeug zur Verfügung steht, mit dem immer mehr Gendefekte behoben werden können. Doch trotz der positiven Nachrichten und prinzipiellen Erfolge garantiert CRIPR/Cas9 nicht zu 100% das gewünschte Ergebnis. Daher muss nach dem Einsatz von CRISPR/Cas9 geprüft werden, ob der erwünschte Genaustausch, im Falle der Punktmutation der Austausch dieser einzelnen Base, auch tatsächlich stattgefunden hat. Hierzu gibt es viele Methoden. Eine der einfachsten und günstigsten davon dürfte die Kontrolle/ Überprüfung der Mutation mit der HiDi oder der HiDiTaq DNA-Polymerase sein.

Viele DNA-Polymerasen jedoch tolerieren fehlgepaarte Primer-Template Komplexe! Die HiDi und HiDiTaq DNA-Polymerase (High Discrimination of single nucleotides) unterscheiden bis zu 100% mittels allelspezifischer PCR und liefern gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren und ergeben so nach einer simplen PCR/qPCR eine eindeutige Aussage, welches Allel vorliegt.

Mittels allelspezifischer PCR kann man die Mutationsrate in einem Pool oder Hintergrund von Wildtyp-Sequenzen quantifizieren. Auch die Überprüfung von Mutationshäufigkeiten, die durch NGS bestimmt wurden, kann mittels allelspezifischer PCR und HiDi DNA-Polymerase verifiziert werden. Damit bietet die HiDi DNA-Polymerase für die Humanmedizin, Lebensmittel und Pflanzenbiotechnologie ein hervorragendes Mittel der Wahl.

Sehr gut geeignet ist die HiDiTaq DNA-Polymerase zur Analyse von Liquid Biopsie Proben. Mit ihr kann die Anwesenheit und Häufigkeit von Krebsmutationen sehr gut analysiert und quantifiziert werden. Die Variante HiDiTaq DNA-Polymerase besitzt 5'-3'-Nuklease Aktivität und kann daher mit spezifischen Primersonden wie Taqman® Sonden oder Molecular beacons eingesetzt werden.

Anwendungsgebiete für die HiDi DNA-Polymerase

- Überwachung, Prüfung und Nachweis von Punktmutationen
- Identifizierung von korrekten oder falschen CRISPR/Cas9 Produkten
- Prüfung und Bestätigung von Sequenzierergebnissen
- Quantifizierung von Mutationen (z.B. NG-Ergebnisse)
- SNP-Detektion bei allelspezifischer Amplifikation (ASA) / allelspezifischer PCR
- Methylierungsspezifische PCRs (MSP) nach Bisulfitbehandlung der DNA (CpG Methylierungsstellen)
- HLA-Genotypisierung
- Multiplex-PCR
- realtime PCR mittels Hydrolysesonden
- realtime Multiplex-PCR
- allelspezifische PCR (ASA, AS-PCR)
- allelspezifische Primer Extension (AS-PEX)

- DamID-seq data in C. elegans / Sharma R, Ritler D, Meister P.

- Minisequencing SNP genotyping with SNPase DNA Polymerase / Lovmar L, Fredriksson M, Liljedahl U, Sigurdsson S, Syvänen AC 

- Allel specific mismatch selectivity by the HiDi DNA polymerase / Drum M, Kranaster R, Ewald C, Blasczyk R, Marx A

 
 

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