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Für besseren Geschmack - Verwenden Sie HiDiTaq zur eindeutigen Identifizierung von Punktmutationen, z.B. in Sake!

Für besseren Geschmack - Verwenden Sie HiDiTaq zur eindeutigen Identifizierung von Punktmutationen!

Wie HiDiTaq DNA-Polymerase Ihnen helfen kann, Mutationen in Hefe zu identifizieren, um den Geschmack z.B. von Sake zu verbessern.

Experimente haben gezeigt, dass HiDi DNA-Polymerase und HiDiTaq DNA-Polymerase im Vergleich zu herkömmlichen Enzymen bessere Ergebnisse bei der Identifizierung von Punktmutationen liefern. Daher werden die speziell mit diesen Eigenschaften entwickelten HiDi-Enzyme zum Goldstandard, wenn es um zuverlässige allelspezifische PCRs geht.

Im Folgenden stellen wir Ihnen ein aktuelles Beispiel aus Japan vor:
Zwei Arten von Sake, die als besonders hochwertig gelten, heißen daiginjo-shu und junmai-daiginjo-shu und werden oft mit dem Hefestamm K1801 hergestellt. Ob bei der Herstellung von Bier, Wein oder Sake: Verschiedene Hefen erzeugen unterschiedliche Geschmacksrichtungen im Endprodukt. Dies liegt einerseits an der Art und Weise, in der die Zucker-Alkohol-Umwandlung durchgeführt wird, andererseits an der Art der Nebenprodukte, die freigesetzt werden. Eine kürzlich identifizierte Mutation in K1801 bewirkt, dass die Hefe große Mengen einer Chemikalie produziert, die Ethylcaproat genannt wird, was einen fruchtigen Geschmack in vielen Sorten von hochwertigem Sake erzeugt. Lesen Sie mehr vom Asian Scientist Magazine unter: https://www.asianscientist.com/2016/07/in-the-lab/gene-mutation-japanese-rice-wine-sake/
Beim Sake-Brauen gibt es, entsprechend wie beim Brauen von Bier, eine Verzuckerung von Stärke (jedoch mittels des Edelschimmelpilzes Kôji) und die alkoholische Gärung mittels Hefe. Der Unterschied ist, dass mit Sake beide Schritte parallel stattfinden. Während der Gärung wandelt der Kojipilz die Reisstärke ständig in Zucker um, während die Hefe diesen Zucker kontinuierlich in Alkohol umwandelt. Dass die beiden Prozesse gleichzeitig stattfinden, ist das Besondere und die Herausforderung daran.

Der japanische Markt akzeptiert Sake aus genetisch modifizierter Hefe jedoch nicht. Daher besteht der nächstliegende Schritt für das Forscherteam darin, möglicherweise Tausende von K1801-Hefezellen zu untersuchen, bis eine natürliche Mutante mit einzig der gewünschten Mutation gefunden wird.
Hier kommt die HiDiTaq DNA Polymerase > ins Spiel, sie kann dabei eine große Hilfe sein. Viele Publikationen haben gezeigt, dass die HiDiTaq Polymerase helfen kann, Hefe-Mutanten zu identifizieren, die Sake mit einem besseren Geschmack produzieren. Durch Screening der Klone mittels Allel-spezifischer PCRs kann baldmöglichst der gewünschte Klon, der die Mutation trägt, identifiziert werden. HiDiTaq-DNA-Polymerase zeigt 5'-3'-Nukleaseaktivität und ist daher für auf Hydrolyse-Sonden basierende qPCR-Assays (Taqman ®, Molecular Beacons, etc.) geeignet.

HiDi DNA-Polymerasen > sind hochselektive DNA-Polymerase-Varianten. Sie wurden für Assays ausgewählt, in denen eine hohe Diskriminierung erforderlich ist, beispielsweise in Allel-spezifischen PCRs oder Methylierungs-spezifischen PCRs. Während viele DNA-Polymerasen fehlgepaarte Primer-Template-Komplexe tolerieren, unterscheidet die HiDi-DNA-Polymerase diese effizient und amplifiziert spezifische PCR-Produkte nur im Fall perfekt passender Primerpaare. Dies macht sie äußerst effizient für Mutationsanalysen, SNP-Detektionen, HLA-Genotypisierungen oder die Analyse von einzelnen CpG-Methylierungsstellen.

Anwendungsgebiete für die HiDiTaq DNA-Polymerase

- Kontrolle und Erkennung von Punktmutationen
- Identifizierung der "richtigen" Klone
- Kontrolle und Validierung von Sequenzierungsergebnissen

Hier sehen Sie Daten der Universität Konstanz (Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Kroth), die erfolgreich HiDi DNA-Polymerase zur Identifikation von Indels durch allelspezifische PCR von Mikroalgen (Phaeodactylum tricornutum) verwendet.

Bereits im letzten Blogbeitrag > wird ein Vergleich der HiDiTaq DNA-Polymerase mit verschiedenen DNA-Polymerasen gezeigt. Viele DNA-Polymerasen amplifizieren auch bei einer Fehlpaarung am 3'-terminalen Ende des Primers, während dies bei den HiDi-Enzymen nicht der Fall ist.

Eigenschaften der HiDi-Polymerasen

Schnell: Benötigt nur die Dauer einer Echtzeit-PCR. Dies ist wesentlich schneller als das Einsenden eines Plasmids zur Sequenzierung, das Warten auf das Sequenzierungsergebnis und die anschließende Auswertung usw.
Einfach (ohne aufwändige Sequenzierung): Die PCR ist in fast jedem Labor etabliert und kann schnell im eigenen (oder im benachbarten) Labor durchgeführt werden. Kein Versand, keine Auswertung der Sequenzierungsergebnisse.
Günstig: Billiger als die Sequenzierung von einzelnen Proben. Eine Sanger-Sequenzierung kostet etwa zwischen 2,50-7,50 €, eine PCR-Reaktion nur wenige Cent.

Detection of a point mutation in FAS2 gene of sake yeast strains by allele-specific PCR amplification (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16233083):

“To identify yeast mutants with a point mutation, detection of the specific mutant alleles is necessary. For this purpose, we applied allele-specific polymerase chain reaction (PCR) to detect the FAS2-1250S dominant mutant allele that encodes an altered fatty acid synthase in Japanese brewer's yeast strains. These strains are known to produce a higher amount of ethyl caproate in Japanese sake. The mutant strains were supposed to be diploid and to contain heterozygous alleles, including wild-type FAS2 and a dominant FAS2-1250S. A set of oligonucleotide primers was designed to contain different nucleotides at their 3′ termini: one type was identical to the wild type and the other to the mutant FAS2. Another set of primers was designed to have an additional mismatch at the second nucleotide from their 3′ termini. By testing with control strains, we established PCR conditions for specific amplification. Using these conditions and a simple template preparation procedure with SDS, the presence of the allele was detected in commercially used sake yeast strains. The method presented here will be useful for the identification of specific yeast strains.”

 Referenzen:

- Goshima T, et al. (2016) Identification of a mutation causing a defective spindle assembly checkpoint in high ethyl caproate-producing sake yeast strain K1801. Biosci Biotechnol Biochem 80(8):1657-62
- Akada R, et al. (2001) Detection of a point mutation in FAS2 gene of sake yeast strains by allele-specific PCR amplification
-
DamID-seq data in C. elegans / Sharma R, Ritler D, Meister P.
- Minisequencing SNP genotyping with SNPase DNA Polymerase / Lovmar L, Fredriksson M, Liljedahl U, Sigurdsson S, Syvänen AC
- Allele specific mismatch selectivity by the HiDi DNA polymerase / 
Drum M, Kranaster R, Ewald C, Blasczyk R, Marx A

 
 
 

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