Optimierung von Annealingtemperatur und anderen Parametern in PCR, Real Time Quantitativer PCR und RT-PCR

Mittlerweile gibt es für PCR, Real Time Quantitative PCR sowie RT-PCR viele unterschiedliche Anbieter und Systeme. Das führt dazu, dass man leicht den Überblick verlieren kann. Dabei bietet sich hierbei die Chance, Forschung und Diagnostik finanziell günstiger zu machen sowie sogar wesentlich zu vereinfachen, da es immer mehr Kits gibt, die aus zwei bis drei getrennten Anwendungsschritten nur noch einen einzigen Schritt machen, zum Beispiel Genaxxons Mastermixe mit HotScriptase RT Polymerase > mit zero-step Protokoll.

Die Anbieter versuchen natürlich, angebotene Kits so gut wie möglich an bestehende Systeme anzupassen. Das ist jedoch nie zu 100% möglich, da jeder Anbieter andere Puffersysteme einsetzt und die jeweilige Pufferzusammensetzung (Salze im Reaktionspuffer) und vor allem der pH-Wert einen deutlichen Einfluss auf die jeweilige Annealingtemperatur haben. Unsere Erfahrung zeigt, dass der Einfluss der Annealingtemperatur auf die PCR, Real Time Quantitative PCR sowie RT-PCR von den Anwendern meist stark unterschätzt wird und sehr oft der letzte Punkt ist, der im PCR-Protokoll geändert wird. Das beruht vermutlich auf der Tatsache, dass mit jedem Oligonukleotid (Primer) eine Tm mitgeliefert wird, die den Eindruck erweckt, diese Temperatur sei die einzig richtige.

Aus diesem Grund ist es im Allgemeinen nicht möglich, das bestehende PCR-Protokoll einfach 1:1 zu übernehmen und zu hoffen, dass es funktioniert. Das ist leider meistens nicht der Fall und führt zur irrigen Annahme, der günstige Kit liefere nicht dieselbe Qualität wie der teure Kit, der bereits verwendet wird.

Dabei ließe sich mit der richtigen Planung Zeit und Geld sparen, wenn bei der Versuchsplanung sorgfältig vorgegangen würde. Empfehlenswert ist es, bei neuen Kits, egal ob nur günstiger oder ein neues System, immer mit einer Gradienten-PCR zu beginnen, da die Annealingtemperatur in der PCR mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit beim neuen Anbieter nicht mit der des bestehenden Anbieters übereinstimmt. Meistens sind das nur 2-3°C, doch ist die Auswirkung enorm und führt sehr oft zu einem komplett negativen Ergebnis. Im Falle eines negativen Ergebnisses wird es auch für den Support schwierig, eine mögliche Korrektur im Versuchsaufbau zu empfehlen.

Mit dem richtigen Vorgehen (Anpassung der PCR-Protokolle im Falle eines neuen Systems) lässt sich viel Zeit und Ärger ersparen.

Einige wichtige Punkte, die Sie beachten sollten, sind im Folgenden aufgelistet.

DNA Template

• Benutzen Sie nur qualitativ hochwertige DNA-Templates
• Ungefähr 10E⁴ Kopien an Ziel-DNA werden benötigt, um nach 25-30 Zyklen ein detektierbares Produkt zu erhalten.
• Benutzen Sie 1pg–1ng Plasmid-DNA oder virale DNA.
• Benutzen Sie 1ng–1µg bei genomischer DNA.
• Höhere DNA-Konzentrationen vermindern die Ampliconspezifität und ergeben z.B. Extrabanden, besonders wenn eine hohe Zyklenzahl eingesetzt wird.
• Höhere DNA-Konzentrationen können eingesetzt werden, wenn kleinere Zyklenzahlen erwünscht sind, um z.B. die Spezifität zu erhöhen.

Primer

• Generell sollten diese 20-30 Nukleotide in der Länge besitzen.
• Der ideale GC-Gehalt liegt bei 40-60%.
• Die GC-Basen sollten möglichst gleichmäßig über den/die Primer verteilt sein.
• Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
• Vermeiden Sie Sekundärstrukturen (z.B. Hairpins) innerhalb der Primer und der potentiellen Dimerisationsbereiche zwischen den verwendeten Primerpaaren.
• Wenn gentechnisch veränderte Stellen (side directed mutagenesis) in die Primer eingebaut werden, dann ist es besser, wenn 5' von der side direkted mutagenesis Stelle noch 4-6 Extrabasen eingebaut werden, damit der Primer auch an der richtigen Stelle annealen kann.
• Die Endkonzentration von jedem Primer sollte zwischen 0,05-1 µM liegen (0,05 µM ist die unterste Grenze), typische Werte liegen zwischen 0,1 und 0,5 µM. 
• Höhere Konzentrationen können eine erhöhte Primerdimerisierung zur Folge haben und falsche Amplifikationsprodukte "generieren" bzw. vortäuschen.
• Bei Primern und Sonden kann man davon ausgehen, dass mit zunehmender Primermenge natürlich zunächst auch die PCR besser läuft (meistens ist zunächst ein früherer Ct-Wert zu erwarten). Mit weiter zunehmender Konzentration ist die PCR aber gesättigt. Neben einem etwas niedrigeren Ct-Wert wird anfänglich bei höherer Primer/Sondenkonzentration meistens auch das Fluoreszenzsignal verstärkt.

• Dazu kommen dann ggf. eine oder mehrere Sonden (hierbei sollte die notwendige Konzentration immer gut ausgetestet werden). Wir empfehlen zwischen 50-500 nM. In diesem Bereich sollten verschiedene Kombinationen ausgetestet werden.

Magnesiumkonzentration

• 1,5-2,0 mM Mg2+ sind optimal für die Wirkung der Taq DNA Polymerase, jedoch hängt die optimale Mg2+ Konzentration sehr stark vom Template, der Pufferzusammensetzung, der Menge an DNA und auch an dNTPs ab, da vor allem die beiden letzteren eine hohe Tendenz haben, Magnesium zu chelatieren und damit der PCR-Reaktion zu entziehen.
• Wenn [Mg2+] zu niedrig ist: Kein PCR-Produkt sichtbar.
• Wenn [Mg2+] zu hoch ist: unerwünschte/falsche PCR-Produkte sind sichtbar. Eventuell ist nur noch ein Schmier zu sehen.

 Deoxynukleotide (dNTPs >)

• Die typische Konzentration beträgt 200 µM von jedem einzelnen dNTP. Grundsätzlich sind 200-400 µM an dNTPs aber eine gute Konzentration für die PCR.
• Eine niedrigere Konzentration von 50-100 µM erhöht die Spezifität, reduziert aber die Ausbeute zum Teil deutlich.
• Eine höhere Konzentration erhöht zwar die Ausbeute besonders bei langen Amplicons, reduziert aber die Spezifität deutlich.

DNA-Polymerase

• Die Wahl der richigen Polymerase ist u.a. abhängig vom Verwendungszweck sowie vom eingesetzten Template (Standard-PCR: Taq DNA Polymerase S > mit hoher Genauigkeit, Taq Polymerase E > mit hoher Ausbeute; Mastermixe: Standard PCR Mastermix > oder RedMasterMix > mit rotem Farbstoff).
• Für die Multiplex PCR gibt es spezielle lyophilisierte Multiplex Mastermixe >.
• Zur Steigerung der Spezifität oder bei schwierigen Templates werden Hot Start Anwendungen empfohlen. Hierfür gibt es spezielle Hot Start Polymerasen >.
• Für PCRs für Klonierungen oder andere Verfahren, die eine geringe Fehlerquote erfordern, gibt es thermostabile High Fidelity Proofreading Polymerasen wie
  Pfunds >,  ExactRun >, ReproFast > oder ReproHot (KOD) Proofreading Polymerase >. Diese Enzyme machen weit weniger Fehler während der Amplifikation und erhöhen die Chancen auf ein fehlerfreies Amplicon.
• Für Genotypisierungen und andere Anwendungen, bei denen eine hohe Unterscheidungsrate (high discrimination) benötigt wird, gibt es eine neue hochselektive DNA Polymerase, SNP Pol DNA Polymerase >. Sie unterscheidet fehlgepaarte Primer-Template Komplexe spezifisch und liefert gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren.
• Für die Real Time Quantitative PCR > gibt es hochspezialisierte qPCR Mastermixe. Hier kommt es bei der Wahl des richtigen Mastermixes auf das verwendete qPCR-Gerät an. So ist darauf zu achten, ob und wieviel ROX im qPCR Mastermix enthalten sein sollte und ob es eher ein Green qPCR Mastermix mit grünem Fluoreszenzfarbstoff > oder ein Probe qPCR Mastermix > ohne Fluoreszenzfarbstoff sein muss. Diesen gibt es auch lyophilisiert bei Raumtemperatur stabil in Beads (LyoBalls >).
• Die Menge an eingesetzter DNA-Polymerase in der PCR-Reaktion kann das PCR-Ergebnis signifikant beeinflussen (verwenden Sie 1,25 - 1,5 units Taq-Polymerase > für einen 50µL-Ansatz).

 Allgemeine Richtlinien

Annealing

• Die Annealingtemperatur sollte mit einem Temperaturgradienten optimiert werden. Auch die Annealingzeit hat einen Einfluss auf das Gelingen. Es gilt, dass der Einsatz eines anderen Mastermixes oder der Einsatz eines Reaktionspuffers eines anderen Anbieters einen gravierenden Einfluß auf die Annealingtemperatur haben kann.
• Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
• Typische Annealingtemperaturen liegen ca. 5°C unterhalb des niedrigsten Tm der eingesetzten Primer. Oft fallen die Temperaturen in den Bereich von 50-60°C.
• Höhere Annealingtemperaturen sollten getestet werden, wenn es zu unspezifischen Banden oder einem Schmier kommt.
• Typsiche Annealingzeiten liegen im Bereich von 15-30 Sekunden.

Extensionstemperatur und -zeiten

• Die Amplicon-Verlängerung wird normalerweise bei 68°C durchgeführt.
• Als allgemeine Regel kann man pro 1000 Basenpaaren von 1 Minute Extensionszeit bei 68°C ausgehen (oder 2 Minuten für 2000 Basenpaare, bzw. 3 Minuten für 3000 Basenpaare). 
• Für PCR-Produkte, die kleiner als 1 kb sind, können 45-60 Sekunden genommen werden (eher 45 Sekunden, wenn es sich nicht um ein Amplicon nahe 1 kb handelt).
• Sowohl bei PCR-Produkten, die länger als 3000 Basenpaare sind, als auch bei PCR-Protokollen, die mehr als 30 Zyklen haben, ist es wahrscheinlich, dass längere Extenstionszeiten benötigt werden. Daher sollte bei längeren Amplicons oder bei höheren Zyklenzahlen nochmals optimiert werden.

Die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt, starken Sekundärstrukturen, niedrigen Konzentrationen oder Amplicons größer 5 kb benötigen sehr oft eine Optimierung der PCR-Bedingungen. Typischerweise sollten 15-30 Sekunden Denaturierung bei 95°C während der PCR durchgeführt werden.