SNP - Allelspezifische Diskriminierung

 

SNP Nachweis
SNPs (ausgesprochen: snips) findet man in allen Genomen. Sie können für eine Vielzahl von Analysen herangezogen werden, inklusive der Mutationsanalyse im Zusammenhang mit verschiedenen Krebsarten, genetischen Krankheiten, mitochondrialer Forschung, Scrapieprädisposition bei Schafen, Verlust der Heterozygosität, Bewertung der Leistungsfähigkeit beim Tierwachstum und sogar bei der Unterscheidung zwischen der Drogen- bzw. Nichtdrogenform von Cannabis.

Die Genaxxon SNP DNA Polymerase ist eine hochselektive DNA Polymerase, die für die allelspezifische Diskriminierung, z.B. in allen allelspezifischen PCRs (ASA), Primer Extensions oder bei methylierungsspezifischen PCRs (MSP). Hier liefert unsere SNP Pol DNA Polymerase sehr gute Ergebnisse. Während viele andere DNA Polymerasen einen Mismatch im Primer-Template-Komplex tolerieren, erkennt unsere SNP Pol Polymerase solche Mismatches und produziert nur dann ein spezifisches Amplicon, wenn das Primer-Template-Paar perfekt zusammen passen. Diese Fähigkeit macht die SNP DNA Polymerase zu einem sehr wertvollen Werkzeug für die SNP Detektion, HLA Genotypisierung, bei der Analyse von einzelnen CpG Methylierungsstelle oder bei der Multiplex PCR.

Für die realtime PCR mit und ohne Probes ist eine “Taq-Polymerasenvariante” erhältlich (SNP PolTaq DNA Polymerase, die eine 5'-3'-Nukleaseaktivität aufweist und daher auch zusammen mit spezifischen Primersonden wie z.B. Molecular beacons oder TaqMan® Sonden eingesetzt werden kann.

Die SNP Genotypisierung identifiziert Einzelnukleotidpolymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)). Es konnte gezeigt werden, dass SNPs für verschiedene genetische Eigenschaften verantwortlich sind, wie die Anfälligkeit für bestimmte Krankheiten, oder die Metabolisierung von Medikamenten.
Die Genotypisierung von SNPs ist eine extrem wichtige Methode für Forscher geworden, die Krankheiten verstehen, untersuchen und behandeln wollen. SNPs treten ungefähr alle 100 bis 300 Basen auf und können mittels verschiedener Techniken, wie RFLP, SSCP, DNA-Sequenzierung, allelspezifischer PCR und mehr nachgewiesen werden.
Eine große Anzahl von Krankheiten, z.B. Sichelzellanämie, β-Thalassämie oder zystische Fibrose haben Ihre Ursache in SNPs. Die Schwere der Krankheit und die Art und Weise, wie unser Körper auf medizinische Behandlungen reagiert, ist ebenfalls durch verschiedene genetische Varianten festgelegt. Eine einzelne SNP kann z.B. eine Mendelsche Krankheit verursachen. So führt zum Beispiel der Austausch einer einzelnen Base im APOE (Apolipoprotein E) Gen zu einem erhöhten Risiko, an Alzheimer zu erkranken. Allerdings ist bei komplexeren Krankheiten nicht ein einzelner SNP verantwortlich, sondern eine koordinierte Aktion verschiedener SNPs, die zusammen eine Krankheitssituation manifestieren, wie wir es bei der Osteoporose sehen.

Die größte Bedeutung von SNPs in der biomedizinischen Forschung liegt darin, genomische Regionen zwischen Gruppen (z.B. Gruppen mit und ohne ein bestimmtes Krankheitsbild) in genomweiten Assoziationsstudien (GWAs) zu untersuchen. SNPs wurden in genomweiten Assoziationsstudien als hochauflösende Marker bei der Genkartierung von Krankheiten bzw. „normalen“ Eigenschaften benutzt. Selbst SNPs ohne sichtbaren Einfluss auf den Phänotyp (so genannte stille Mutationen) sind in genomweiten Assoziationsstudien immer noch als genetische Marker sehr nützlich, da sie sehr häufig auftreten und über Generationen stabil vererbt werden. Das Wissen über SNPs hilft, die Pharmakokinetik (PK) oder die Pharmakodynamik von Medikamenten in verschiedenen Individuen mit unterschiedlichen genetischen Varianten zu verstehen. Dies kann dazu führen, dass SNPs maßgebliche pharmakogenomische Ziele für die Medikamententherapie werden, da einige SNPs nachweislich mit der unterschiedlichen Metabolisierung von Medikamenten in Zusammenhang gebracht werden können.

Beispiel

Cilantro (Koriander):
Über Geschmack lässt sich nicht streiten!
Manche Leute mögen Koriander in ihrem Essen, andere hassen ihn. Die Ursache liegt in einer SNP-Mutation (rs72921001), nachgewiesen in genomischer HeLa DNA. Diese spezielle SNP ist nahe einer Anzahl von Genen lokalisiert, die für die Geschmacksrezeptoren codieren. (Referenz: Eriksson N. et al. (2012), "A genetic variant near olfactory receptor genes influences cilantro preference.")

Berücksichtigt man, dass nur C-Allel spezifische Primer verlängert werden und in einem spezifischen Amplicon resultieren, können wir daraus schließen, dass die Eigenschaft, Koriander mit einem „seifigen“ Geschmack zu verbinden, auf einer genetisch bedingten Veranlagung, basierend auf dem entspechenden SNP, beruht.
Hierzu wurde eine allelspezifische PCR aus 1ng/µL HeLa gDNA in Gegenwart eines spezifischen realtime Fluoreszenzfarbstoffs und der SNP Pol Polymerase durchgeführt, die nur bei Vorhandensein des C-allelspezifischen Primers ein Signal ergibt. Die SNP Pol Polymerase konnte den Mismatch im A-allelspezifischen Primer so gut unterscheiden, dass selbst nach 50 PCR-Zyklen keine Amplifikation zu erkennen war.
 
Zusätzlich wurden die PCR-Produkte auf einem 2,5%igen Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Die einzelnen Banden wurden mit Ethidiumbromid angefärbt, wobei die positive C-allelspezifische Bande eine Größe von 109bp aufweist.

 

 

SNP PolTaq DNA Polymerase amplifiziert nur Primer, die am 3’-Ende 100%ig passen und unterscheidet diese von falsch gepaarten Primern!

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