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Genaxxon - Tipps für die erfolgreiche RealTime PCR

Die RealTime PCR, auch bekannt als quantitative oder qPCR, ist ein sehr effektives Mittel, um die Amplifikation von DNA in-vitro zu messen und die spezifischen Fragmente ohne Agarosegele sichtbar zu machen. Wie der Begriff "RealTime" schon aussagt, wird bei dieser Methode die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit gemessen.

Bei der RealTime PCR werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Verfahren heran gezogen, die es ermöglichen sollen, während der PCR die Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente zu detektieren und um einen starken Anstieg im Fluoreszenzsignal während der PCR zu erhalten und dadurch zu quantifizieren.

Für die erfolgreiche RealTime PCR beachten Sie bitte folgende Tipps:

- Beachten Sie die Anforderungen Ihres Thermocyclers, was zum Beispiel die ROX-Konzentration in Ihrem Mastermix betrifft!

- Bei Verwendung von Sonden sollte die Länge des Zielfragments zwischen 90 und 250 bp liegen.

- Bewahren Sie Primer zum Schutz der Stabilität in einem Puffer mit neutralem pH-Wert auf.
DNA kann nach Resuspendieren in Wasser mit erniedrigtem pH-Wert (vor allem, wenn es DEPC behandelt wurde) mit der Zeit Schaden nehmen. Wir empfehlen die Verwendung einer gepufferten Lösung mit neutralem pH-Wert oder 1 mM EDTA in der Stock-Lösung.

- Aliquotieren Sie Ihre Primer, um Schäden durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. So wird auch die Gefahr einer Kontamination der Stock-Lösung verringert.

- Erstellen Sie zunächst eine Standardkurve für jedes neue Primerpaar, um die Effizienz zu prüfen

- Mischen Sie die Reagenzien gut vor Gebrauch!
Durch die Lagerung in Gefrierschrank oder Kühlschrank kommt es zum teilweisen Absetzen einzelner Reagenzienbestandteile (Farbstoffe, Nukleotide, Enzyme). Um eine ungleichmäßige Verteilung der Reagenzien in Ihren Proben zu vermeiden, ist gutes Mischen unbedingt erforderlich.

- Vermeiden Sie beim Mischen das Entstehen von Luftbläschen, da diese die Fluoreszenzdetektion beeinträchtigen können!

- Verdünnen Sie das Template (weniger ist oft mehr)!
Bisweilen ergibt sich eine genauere Messung dadurch, dass weniger Template verwendet wird. Die Sensitivität einer RealTime PCR ist hierfür ausreichend! Störende Einflüsse von Inhibitoren aus dem Reinigungsschritt in der Probe (zum Beispiel Guanidinsalze oder Ethanol) können somit vermieden werden.

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