TEV Protease - aus Tobacco Etch Virus

TEV-Protease ist eine hochspezifische Cysteinprotease aus dem Tobacco Etch Virus (TEV). Aufgrund ihrer hohen Sequenzabhängigkeit ist die TEV-Protease spezifischer als Faktor Xa, Thrombin oder Enterokinase. Damit ist die TEV-Protease ein sehr leistungsfähiges Tool zur Spaltung von Fusionsproteinen um Affinitätstags von gereinigten Proteinen zu entfernen. TEV gehört zur Familie der C4 Peptidasen.

Die TEV-Protease erkennt ein lineares Epitop der allgemeinen Form E-X-X-Y-X-Q-S/G (Glu, X, X, Tyr, X, Gln, Ser/Gly), wobei die optimale Erkennungssequenz des Enzyms die Sequenz: Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser/Gly (ENLYFQS/G) ist. Die TEV-Protease schneidet zwischen Q (Gln) und S (Ser) oder G (Gly). Die kanonische Sequenz lautet ENLYFQS, wobei N (Asn) im wesentlichen durch jede beliebige Aminosäure ersetzt werden kann.

Wirkmechanismus: TEV-Protease, als Cysteinprotease, wird nicht von Serinproteaseinhibitoren beeinflußt, obwohl der Enzymmechanismus an die katalytische Triade von Serinproteasen erinnert. 

Proteaseinhibitoren und deren Einfluß auf TEV-Protease: PMSF, AEBSF oder Pefabloc SC (1mM), TLCK (1mM), Bestatin (1mg/mL), Pepstatin A, EDTA (1mM) und E-64 (3mg/mL) haben keinen Effekt auf die katalytische Aktivität der TEV-Protease. Zink-Ionen inhibieren die Aktivität der TEV-Protease bei Konzentrationen von 5mM oder darüber. 

TEV-Protease von Genaxxon enthält ein N-terminales Poly-Histidin-Tag (28.6 kDa) und eine Mutation bei Aminosäure 219 (S219V), die die TEV-Protease vor Autoinaktivierung schützt. 

Reaktionsbedingungen: Die Spaltungsreaktion mit der TEV-Protease wird generell in 50mM Tris/HCl, pH8.0, 0.5mM EDTA, 1mM DTT für 1 Stunde bei 30°C durch geführt. Andere Bedingungen, wie niedrigere Temperaturen (RT oder +4°C) oder der Zusatz von 1mM TCEP anstelle von DTT können ebenfalls durch geführt werden. Wenn andere als die Standardbedingungen eingesetzt werden, muss die Menge an TEV-Protease, die Inkubationszeit und/oder die Temperatur neu optimiert werden.

Die optimale Salzkonzentration beträgt 0mM NaCl. Es kann bis zu 200mM NaCl eingesetzt werden, was aber zu einem Verlust der Aktivität auf ungefähr ein Drittel des "normalen" Wertes führt.