Wieso wird bei der realtime PCR ROX als passiver Referenzfarbstoff eingesetzt und welchen Einfluss hat ROX auf die Auswertung der PCR in der realtime PCR? Kann zuviel ROX die Auswertung negativ beeinflussen?
Die Standard-PCR-Amplifikation erforderte früher oft eine aufwendige DNA-Extraktion, Reinigung, Verarbeitung und Probenaufbereitung. Dabei wurden aus heutiger Sicht noch relativ primitive Geräte und komplexe Protokolle verwendet. Die Vorstellung, dass 35 PCR-Amplifikationszyklen in weniger als 25 Minuten abgeschlossen werden könnten, ohne die Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu beeinträchtigen, wurde als Zukunftsvision angesehen.

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The qPCR and Digital PCR Conference started with lectures on the reliability of qPCR and ddPCR, from their technical limitations to the interpretation of results to errors in published data with a very interesting presentation by Prof. Stephen Bustin.

miRNAs in der Genexpression

miRNAs kommen natürlich im tierischen und pflanzlichen Organismus vor. Sie sind hochkonserviert und spielen eine große Rolle bei der Genregulation, speziell dem Gen-Silencing. Sie haben eine wichtige Funktion bei der Zelldifferenzierung und Dedifferenzierung, zum Beispiel bei der weiblichen Fruchtbarkeit und der Präimplantationsentwicklung

Digitale PCR (dPCR)

Mit Hilfe der dPCR oder digitalen PCR erfolgt digital eine absolute Messung von Nukleinsäuren, ohne eine exponentielle Amplifikation der DNA vorzunehmen. Dabei werden im Gegensatz zur herkömmlichen Realtime PCR (qPCR) keine Standardkurven, Berechnung eines Ct-Wertes oder Referenzen benötigt, da nur ein einzelner Amplifikationsschritt durchgeführt wird, um eine Ja/Nein Antwort zu erhalten. Bei der dPCR werden ähnliche Reagenzien wie bei der Standard PCR verwendet Es wird die absolute Anzahl an individuellen Zielmolekülen gezählt.