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Einfluss von ROX auf den Ct-Wert

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Datum: February 1, 2019 12:00
Wieso wird bei der realtime PCR ROX als passiver Referenzfarbstoff eingesetzt und welchen Einfluss hat ROX auf die Auswertung der PCR in der realtime PCR? Kann zuviel ROX die Auswertung negativ beeinflussen?

Ct-Wert, Optische Systeme und passiver Referenzfarbstoff 

Ein Ct-Wert (auch Cp- oder Cq-Wert, abgekürzt für engl. threshold cycle) ist eine theoretische Größe, die aus dem Schnittpunkt eines vorab festgelegten unteren Werts (treshold) und einer gegebenen Amplifikationskurve abgeleitet wird. Sie gibt die relative Konzentration der anfänglich vorhandenen Ziel-DNA in der qPCR-Reaktion an. Verschiedene, probenunabhängige Faktoren haben einen mehr oder weniger deutlichen Einfluss auf den Ct-Wert. Das sind: Das optische System, der PCR-Mastermix, Einstellung des Treshold-Werts und die Einstellung des Grundlinienwerts. Hinzu kommt noch, ob ein passiver Referenzfarbstoffs wie ROX für ein spezielles Gerät benötigt wird bzw. in der qPCR-Reaktion bereits vorhanden ist. 

Wie beeinflusst ein passiver Referenzfarbstoff den Ct-Wert? 

Hierzu ist es vorab wichtig zu verstehen, wie realtime PCR-Geräte funktionieren. Bei vielen Geräten, vor allem älteren Typs, gibt es eine stationäre Lichtquelle, die alle Wells des PCR-Blocks ausleuchtet. Gleichzeitig ist auch das Detektionssystem stationär. Dies ergibt unterschiedliche Laufwege des Lichts zu den verschiedenen Wells und zurück zur Detektionsquelle. Die Variation der Lichtweglängen führt zu unterschiedlichen absoluten Fluoreszenzmessungen für jedes Well, selbst wenn dieselbe Menge an Ziel-DNA enthalten ist. So haben z.B. Wells mit einem kürzeren Lichtweg (diese befinden sich typischerweise in der Mitte des Blocks) einen höheren Fluoreszenzwert im Vergleich zu einem Well mit einem längeren Lichtweg (typischerweise am Rand des PCR-Blocks). Die Unterschiede in den Lichtwegen und damit den absoluten Fluoreszenzmesswerten würden nun das Ergebnis der qPCR-Auswertung beeinflussen, wenn die gemessenen Fluoreszenzwerte nicht normalisiert werden würden. 

Normalisierung der qPCR-Messwerte mittels eines Referenzfarbstoffs 

Bei der qPCR-Datenverarbeitung wird die Probenfluoreszenz für jedes Well zunächst vom Wert des Referenzfarbstoffs abgezogen. Zur Normalisierung der Fluoreszenzintensität teilt die qPCR-Software die Emissionsintensität der Reporterfarbstoffe durch die Emissionsintensität eines Referenzfarbstoffs. Es hat sich eingebürgert, dass ROX (Carboxy-X-Rhodamin) als passiver Referenzfarbstoff in realtime PCR-Systemen verwendet wird, um Unterschiede in den Fluoreszenzwerten zu normalisieren. ROX ist nicht an der PCR-Reaktion beteiligt und stört diese in den "normalen" Konzentrationen von 0nM bis 600nM nicht (keine Wechselwirkung mit der DNA oder der DNA-Polymerase), so dass die Zugabe von ROX zu einem qPCR-Mastermix ein konstantes Fluoreszenzsignal während der gesamten Amplifikation ergibt. Die Konstanz der ROX-Fluoreszenz kann daher als Basiswert zur Normalisierung herangezogen werden. Die angebotenen qPCR-Mastermixe werden nun hauptsächlich mit unterschiedlichen ROX-Konzentrationen angeboten, da Geräte verschiedener Hersteller unterschiedliche optische Konfigurationen aufweisen, die wiederum unterschiedliche ROX-Konzentrationen als Basiswert für die Normalisierung benötigen. Der Grund dafür liegt insbesondere in der Art der Anregungsquelle (Laser, LED der verwendeten Optik und der Art, wie das Anregungslicht zum Well geleitet wird (starre Lichtquelle, bewegter Schlitten, feste Quelle für jedes Well). 
Um diesen Unterschieden Rechnung zu tragen, bietet Genaxxon drei unterschiedliche Konzentrationen an ROX an: ohne ROX (M3023M3045), low ROX (M3011M3031), high ROX(M3010M3052). 
Versuche von Kunden zeigen jedoch, dass auch Geräte, die 50nM ROX benötigen, mit einem Mastermix funktionieren, der 500nM ROX enthält. Hierzu bedarf es eventuell einer geänderten Einstellung am qPCR-Gerät. 

Normalisierungsberechnung - normalisierte Reporterfluoreszenzintensität Rn 

Um qPCR-Daten zu normalisieren, wird die Fluoreszenzemissionsintensität des Reporter-Farbstoffs (zum Beispiel SYBR® Green) durch die Fluoreszenzemissionsintensität des passiven Referenzfarbstoffs geteilt. Dieses Verhältnis wird normalisierte Reporterintensität oder Rn genannt (s. Tabelle 1). Zur weiteren Verbesserung der Messwerte werden die sogenannten Rn+ und Rn- benötigt. Rn+ ist der Rn von PCR-Reaktionen, die ein Signal ergeben, dass über dem Treshhold liegt. Rn- ist die Basislinienfluoreszenz, die aus den frühen Zyklen abgeleitet werden kann bzw. als Treshold festgelegt wird. Um die Reporterfluoreszenzintensität oberhalb der Grundlinie zu bestimmen, wird nun ΔRn als (Rn +) - (Rn-) berechnet. 
Tabelle 1: Rn-Berechnung für jeweils zwei unterschiedlich positionierte Wells (zentral bzw. peripher gelegen). Die Änderung der Fluoreszenz wird durch Normalisierung des Fluoreszenzreportersignals auf das Fluoreszenzsignal des passiven Referenzfarbstoffs berichtigt.

Fluoreszenzintensität, relative fluorescence units (RFU)

Well

Reporterfarbstoff

Passiver Referenzfarbstoff

Rn

Mitte des Blocks

3000

1500

2

Peripherie des Blocks

2000

1000

2


 Weiterführende Literatur: Ruijter, J. M., Zhao, S., Spiess, A. N., Boggy, G., Blom, J., Rutledge, R. G., … Vandesompele, J. (2013). Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods, 59(1), 32–46. https://doi.org/10.1016/J.YMETH.2012.08.011