cDNA-Synthese direkt aus Zellen ohne Reinigung oder Lysis

Genaxxons neuer
HotScriptase RT Cell Mastermix:
Für die cDNA-Synthese direkt aus Zellen, es ist keine zeitaufwendige und teure Zell-Lysis oder vorherige RNA-Reinigung mehr notwendig.

Unser neuer HotScriptase RT Cell Mastermix ermöglicht die reverse Transkription mit gleichzeitiger Amplifikation aus Zellen oder Cell Mastermix RT-PCR und Realtime PCRZellsuspensionen schnell und zuverlässig ohne vorherige Isolierung der mRNA. Geben Sie Ihre Zellen einfach direkt zur PCR-Reaktion und starten Sie.

Es werden nur ca. 100 - 10.000 Zellen pro Ansatz benötigt. Zudem entfällt bei der im Mastermix verwendeten, sehr thermostabilen HotScriptase RT Polymerase der isothermale Zwischenschritt. Der gesamte Ansatz kann sofort sehr heiß gestartet werden. Die RT-Reaktion findet während der "normalen" Extension statt. Dies erweist sich gerade bei der cDNA-Synthese als vorteilhaft.

Der gesamte Prozess wird somit stark verkürzt, wodurch einem vorzeitigen Zerfall der empfindlichen und kostbaren RNA entgegengewirkt wird.

RT-PCR mit gleichzeitiger RealTime PCR:

Die Quantifizierung und Detektion von RNA ist direkt aus der Zellsuspension ohne separate Lysis oder zusätzliche Reinigungsschritte möglich. Der Mastermix ist speziell geeignet für kurze Fragmente zwischen 60 und 300bp. 

Bei der Direkt-PCR aus Zellen, vor allem aus Blut, stört das Zellmaterial normalerweise die RealTime PCR. Das ist mit dem HotScriptase RT Cell Mastermix kein Problem mehr: Einfach die Menge an Fluoreszenzfarbstoff erhöhen (z.B. SYBR® Green bis 1:30 anstatt 1:1 einsetzen), dann kann erneut ein Signal detektiert werden.

Wir empfehlen den Einsatz von RNA-spezifischen Primern, die in der Exon-Exon-Region binden, um die Amplifikation genomischer DNA auszuschließen. Diese ist normalerweise von vornherein im Zellgemisch enthalten. Werden unspezifische Primer verwendet, erhält man eine Standard-PCR anstatt einer RT-PCR.

Der Genaxxon HotScriptase RT Cell Mastermix ist ideal geeignet für Hochdurchsatz-Anwendungen, RNAi Knockdown, RealTime PCR, Genexpressions-Experimente sowie im "Next Generation Sequencing".  

 

 

> Protocol for direct RT-PCR from cells

For adherent cell cultures: follow all steps below.
For suspension cultures: skip steps 1-4 and start with step 5.

1. Remove media from cell culture dish/flask and add an appropriate volume of 1x PBS (use 10mL PBS for 10cm dish or T75 flask) to wash the cells.
2. Remove the PBS and add trypsin (or better Accutase – cat#: C4356) to detach your cells (use enough trypsin to cover the cells e.g 1mL trypsin for a 10cm dish or 3mL trypsin for a T75 flask).
3. Incubate at 37°C or at room temperature and check cell detachment under a microscope every 2 min until you see the cells have all detached.
4. Once the cells have detached, add medium containing serum to inactivate trypsin (for each 1mL of trypsin add 2mL of serum containing medium).
5. Transfer the cell suspension to a centrifuge tube and centrifuge at 1300rpm for 3 min at room temperature to pellet the cells.
6. Remove the supernatant and resuspend the cell pellet in 1mL-10mL 1xPBS according to the size of the pellet to determine the total cell count (this will also wash the cells and get rid of any remaining medium).
7. Count the cells from ~10µL of the cell suspension using a hemocytometer counting chamber or an electronic counter.
8. Centrifuge again at 1300rpm for 3 min at room temperature to pellet the cells.
9. Now prepare the template for your PCR reaction: Aspirate the supernatant and resuspend the pellet in an appropriate amount of nuclease-free water to achieve cell density of max. 5000 cells/μL (for a final cell number of 10.000 cells/reaction). Alternatively, prepare several tubes of different cell densities ranging from 50 to 5000 cells/μL (100-10.000 cells/reaction) in order to investigate the optimal number of cells per reaction for your future experiments. Keep the suspensions on ice and always prepare fresh before PCR.

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