0,00 €*
Positionen anzeigen
 
 

CRISPR/Cas9 - Punktmutationen - Alzheimer - Verifikation

Falscher Buchstabe im Erbgut? Das war bisher fatal!
Punktmutationen sind Ursache vieler Erbkrankheiten und gelten als Risikofaktoren beispielsweise für Alzheimer. Eines der einfachsten und günstigsten Mittel zum Nachweis für Punktmutationen ist die HiDi > bzw. für die Realtime PCR die HiDiTaq DNA-Polymerase > (High Discrimination).

Eine der Hauptursachen für viele erbliche Krankheiten ließ sich bis Mitte 2016 selbst mit dem „Superwerkzeug“ CRISPR/Cas9 nicht präzise genug beseitigen: die Punktmutation. Setzte man dafür die Genschere ein, kam es häufig zu zufälligen Einfügungen oder dem Wegfall ganzer DNA-Sequenzen. Diese als "indels" bezeichneten Fehler treten auf, weil das Schneiden des DNA-Doppelstrangs zelleigene Reparaturmechanismen aktiviert, die dann diese Fehler verursachen.
David Liu und seine Kollegen von der Harvard University in Cambridge haben jedoch CRISPR/Cas9 zusammen mit einem Cytidindeaminase-Enzym so modifiziert, dass die Genschere die DNA nicht mehr schneidet. Dadurch entfällt das Problem der unerwünschten Indels. Stattdessen kann die Genschere nun mit Hilfe angehängter Enzyme direkt im DNA-Strang eine Base in eine andere umwandeln – und so die Punktmutationen korrigieren bzw. gezielt setzen.

Die spontane Desaminierung von Cytosin ist einer der Hauptgründe für die Umwandlung von C/G  zu T/A - Basenpaaren, die ursächlich für ca. die Hälfte aller bekannten pathogenen Punktmutationen beim Menschen sind. Die von Gaudelli et al. beschriebene zielgerichtete Umwandlung von  A/T-Basenpaaren in G/C könnte daher die Erforschung und Behandlung genetischer Erkrankungen vorantreiben. (Gaudelli et al., Nature 2017).

Auf diesem Weg ist es gelungen, mittels CRISPR/Cas9 erstmals eine solche Punktmutation im Alzheimer-Risikogen APOE4 zu korrigieren, wie im Fachmagazin "Nature" berichtet wird. Allein in den Vereinigten Staaten leiden über fünf Millionen Menschen an dieser tödlichen Erkrankung. Mit Hilfe der neuartigen CRISPR / Cas9-Technologie soll das weitere Fortschreiten der Symptome im Wesentlichen blockiert werden. An der University of Madison werden in Zusammenarbeit mit Bioingenieuren Nanopartikel konstruiert, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden und das CRISPR / Cas9-Protein ins Gehirn transportieren sollen.

Das Beispiel zeigt, dass mit CRISPR/Cas9 offensichtlich ein Werkzeug zur Verfügung steht, mit dem immer mehr Gendefekte behoben werden können. Doch trotz der positiven Nachrichten und prinzipiellen Erfolge garantiert CRIPR/Cas9 nicht zu 100% das gewünschte Ergebnis. Daher muss nach dem Einsatz von CRISPR/Cas9 geprüft werden, ob der erwünschte Genaustausch, im Falle der Punktmutation der Austausch dieser einzelnen Base, auch tatsächlich stattgefunden hat. Hierzu gibt es viele Methoden. Eine der einfachsten und günstigsten davon dürfte die Kontrolle/ Überprüfung der Mutation mit der HiDi oder der HiDiTaq DNA-Polymerase sein. Der Primer muss dabei einfach auf die vermutete  Punktmutation (3'-Ende = Punktmutation) gesetzt werden und die HiDi Polymerase erkennt daraufhin mit 100%-iger Genauigkeit, ob eine Punktmutation vorhanden ist oder nicht: Wenn das 3'-Ende die Mutation zeigt und der Primer nicht, dann findet keine Amplifikation statt.

Im Fall der CRISPR / Cas9-Technologie ist es wichtig zu bestätigen, dass im Falle einer Punktmutation tatsächlich der Austausch einer einzelnen Base stattgefunden hat. Dies kann leicht durch Verwendung von HiDi nach CRISPR / Cas9 bestätigt werden.

Viele DNA-Polymerasen jedoch tolerieren fehlgepaarte Primer-Template Komplexe! Die HiDi und HiDiTaq DNA-Polymerase (High Discrimination of single nucleotides) unterscheiden bis zu 100% mittels allelspezifischer PCR und liefern gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren und ergeben so nach einer simplen PCR/qPCR eine eindeutige Aussage, welches Allel vorliegt.

Mittels allelspezifischer PCR kann man die Mutationsrate in einem Pool oder Hintergrund von Wildtyp-Sequenzen quantifizieren. Auch die Überprüfung von Mutationshäufigkeiten, die durch NGS bestimmt wurden, kann mittels allelspezifischer PCR und HiDi DNA-Polymerase verifiziert werden. Damit bietet die HiDi DNA-Polymerase für die Humanmedizin, Lebensmittel- und Pflanzenbiotechnologie ein hervorragendes Mittel der Wahl.

Sehr gut geeignet ist die HiDiTaq DNA-Polymerase zur Analyse von Liquid Biopsie Proben. Mit ihr kann die Anwesenheit und Häufigkeit von Krebsmutationen sehr gut analysiert und quantifiziert werden. Die Variante HiDiTaq DNA-Polymerase besitzt 5'-3'-Nuklease Aktivität und kann daher mit spezifischen Primersonden wie Taqman® Sonden oder Molecular beacons eingesetzt werden.

Anwendungsgebiete für die HiDi DNA-Polymerase

- Überwachung, Prüfung und Nachweis von Punktmutationen
- Identifizierung von korrekten oder falschen CRISPR/Cas9-Produkten
- Prüfung und Bestätigung von Sequenzierergebnissen
- Quantifizierung von Mutationen (z.B. NG-Ergebnisse)
- SNP-Detektion bei allelspezifischer Amplifikation (ASA) / allelspezifischer PCR
- Methylierungsspezifische PCRs (MSP) nach Bisulfitbehandlung der DNA (CpG Methylierungsstellen)
- HLA-Genotypisierung
- Multiplex-PCR
- realtime PCR mittels Hydrolysesonden
- realtime Multiplex-PCR
- allelspezifische PCR (ASA, AS-PCR)
- allelspezifische Primer Extension (AS-PEX)

 

 

Literatur:
- DamID-seq data in C. elegans / Sharma R, Ritler D, Meister P.
- Minisequencing SNP genotyping with SNPase DNA Polymerase / Lovmar L, Fredriksson M, Liljedahl U, Sigurdsson S, Syvänen AC
- Allele specific mismatch selectivity by the HiDi DNA polymerase / Drum M, Kranaster R, Ewald C, Blasczyk R, Marx A

 
 
 
 
 
 

Passende Artikel

Kein Bild vorhanden single guide RNA - custom made

The design and synthesis of guide RNA requires expertise and experience, and is time-consuming! If you need high-quality custom made guide RNA (gRNA) as a tool for your CRISPR/Cas9 experiment, don't worry. Genaxxon bioscience offers ready-to-transfect gRNA for its customers. These guide RNAs are combined crRNA and tracrRNAs, so each guide RNA is a single RNA molecule of about 100 nt. Our gRNA sequences fold into an optimized scaffold with...

145,80 € *

HiDi DNA-Polymerase

Hidi DNA-Polymerase für die einfache, verlässliche und schnelle spezifische Unterscheidung von Allelen, z. B. bei CRISPR/Cas9-gesetzten Punktmutationen, beim Erkennen falscher CRISPR/Cas9-Produkte oder bei der Validierung von Sequenzierergebnissen. Die HiDi DNA-Polymerase erkennt höchst spezifisch, ob eine Fehlpaarung (Mismatch) des Primer-Template-Komplexes vorliegt oder nicht. Die Fehlpaarung (Punktmutation) muss sich am...

ab 15,00 € *

HiDiTaq DNA-Polymerase

Hidi DNA-Polymerase für die einfache, verlässliche und schnelle allelspezifische Diskriminierung, z. B. von CRISPR/Cas9-gesetzten Punktmutationen, für das Erkennen falscher CRISPR/Cas9-Produkte oder zur Validierung von Sequenzierergebnissen. Die HiDi DNA-Polymerase unterscheidet hochspezifisch, ob eine Fehlpaarung (Mismatch) des Primer-Template-Komplexes vorliegt oder nicht. Die Fehlpaarung (Punktmutation) muss sich am...

ab 15,00 € *

Kein Bild vorhanden No target guide RNA for CRISPR

Purified gRNA, which has no genomic target in human, rat and mouse. This non-targeting gRNA serves as a tool for establishing non-toxic transfection conditions, or as a negative control in down-stream assays, monitoring the success of a genome editing experiment.

69,00 € *

Kein Bild vorhanden GFP-targeting guide RNA for CRISPR

Purified gRNA, which targets sequences encoding green-fluorescent protein (GFP), or enhanced GFP. This GFP-targeting gRNA may serve as a positive control in down-stream assays, monitoring the success of CRISPR/Cas9 genome editing experiments.  All you need is a cell line stably expressing one copy of (E)GFP. If your transfection conditions and CRISPR/Cas9 components are working, the GFP locus will be mutated. The resulting loss of GFP...

69,00 € *

Kein Bild vorhanden Kontrollpeptid Amyloid-beta (40-1) human

Amyloid-ß-peptides: Characteristic of Alzheimer disease is the accumulation of amyloid plaques in the brain. The major components of these plaques are 39-42 residue-long amyloid-ß-peptides, which form insoluble fibrils via self-assembly. The amyloid-ß-peptides are fragments of the broadly distributed, membrane-bound amyloid precursor protein APP, encoded on chromosome 21. They are formed from the proteolytic cleavage of APP...

ab 220,60 € *

Kein Bild vorhanden Amyloid-beta (1-40) human -...

Amyloid-beta (1-40) human is an Alzheimer desease peptide. Characteristic of Alzheimer disease is the accumulation of amyloid plaques in the brain. The major components of these plaques are 39-42 residue-long amyloid-ß-peptides, which form insoluble fibrils via self-assembly. The amyloid-ß-peptides are fragments of the broadly distributed, membrane-bound amyloid precursor protein APP, encoded on chromosome 21. They are formed from...

ab 220,60 € *

 
 

Kommentar schreiben

 

Die mit einem * markierten Felder sind Pflichtfelder.