CRISPR/Cas9 - Punktmutationen - Alzheimer - Verifikation

Falscher Buchstabe im Erbgut? Das war bisher fatal!
Punktmutationen sind Ursache vieler Erbkrankheiten und gelten als Risikofaktoren beispielsweise für Alzheimer. Eines der einfachsten und günstigsten Mittel zum Nachweis für Punktmutationen ist die SNP Pol Polymerase > bzw. für die Realtime PCR die SNP PolTaq DNA-Polymerase > (High Discrimination).

Eine der Hauptursachen für viele erbliche Krankheiten ließ sich bis Mitte 2016 selbst mit dem „Superwerkzeug“ CRISPR/Cas9 nicht präzise genug beseitigen: die Punktmutation. Setzte man dafür die Genschere ein, kam es häufig zu zufälligen Einfügungen oder dem Wegfall ganzer DNA-Sequenzen. Diese als "indels" bezeichneten Fehler treten auf, weil das Schneiden des DNA-Doppelstrangs zelleigene Reparaturmechanismen aktiviert, die dann diese Fehler verursachen.
David Liu und seine Kollegen von der Harvard University in Cambridge haben jedoch CRISPR/Cas9 zusammen mit einem Cytidindeaminase-Enzym so modifiziert, dass die Genschere die DNA nicht mehr schneidet. Dadurch entfällt das Problem der unerwünschten Indels. Stattdessen kann die Genschere nun mit Hilfe angehängter Enzyme direkt im DNA-Strang eine Base in eine andere umwandeln – und so die Punktmutationen korrigieren bzw. gezielt setzen.

Die spontane Desaminierung von Cytosin ist einer der Hauptgründe für die Umwandlung von C/G  zu T/A - Basenpaaren, die ursächlich für ca. die Hälfte aller bekannten pathogenen Punktmutationen beim Menschen sind. Die von Gaudelli et al. beschriebene zielgerichtete Umwandlung von  A/T-Basenpaaren in G/C könnte daher die Erforschung und Behandlung genetischer Erkrankungen vorantreiben. (Gaudelli et al., Nature 2017).

Auf diesem Weg ist es gelungen, mittels CRISPR/Cas9 erstmals eine solche Punktmutation im Alzheimer-Risikogen APOE4 zu korrigieren, wie im Fachmagazin "Nature" berichtet wird. Allein in den Vereinigten Staaten leiden über fünf Millionen Menschen an dieser tödlichen Erkrankung. Mit Hilfe der neuartigen CRISPR / Cas9-Technologie soll das weitere Fortschreiten der Symptome im Wesentlichen blockiert werden. An der University of Madison werden in Zusammenarbeit mit Bioingenieuren Nanopartikel konstruiert, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden und das CRISPR / Cas9-Protein ins Gehirn transportieren sollen.

Das Beispiel zeigt, dass mit CRISPR/Cas9 offensichtlich ein Werkzeug zur Verfügung steht, mit dem immer mehr Gendefekte behoben werden können. Doch trotz der positiven Nachrichten und prinzipiellen Erfolge garantiert CRIPR/Cas9 nicht zu 100% das gewünschte Ergebnis. Daher muss nach dem Einsatz von CRISPR/Cas9 geprüft werden, ob der erwünschte Genaustausch, im Falle der Punktmutation der Austausch dieser einzelnen Base, auch tatsächlich stattgefunden hat. Hierzu gibt es viele Methoden. Eine der einfachsten und günstigsten davon dürfte die Kontrolle/ Überprüfung der Mutation mit der SNP Pol Polymerase > oder der SNP PolTaq DNA-Polymerase > sein. Der Primer muss dabei einfach auf die vermutete  Punktmutation (3'-Ende = Punktmutation) gesetzt werden und die SNP Pol Polymerase erkennt daraufhin mit 100%-iger Genauigkeit, ob eine Punktmutation vorhanden ist oder nicht: Wenn das 3'-Ende die Mutation zeigt und der Primer nicht, dann findet keine Amplifikation statt.

Im Fall der CRISPR / Cas9-Technologie ist es wichtig zu bestätigen, dass im Falle einer Punktmutation tatsächlich der Austausch einer einzelnen Base stattgefunden hat. Dies kann leicht durch Verwendung von SNP POl nach CRISPR / Cas9 bestätigt werden.

Viele DNA-Polymerasen jedoch tolerieren fehlgepaarte Primer-Template Komplexe! Die SNP Pol und SNP PolTaq DNA-Polymerase (High Discrimination of single nucleotides) unterscheiden bis zu 100% mittels allelspezifischer PCR und liefern gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren und ergeben so nach einer simplen PCR/qPCR eine eindeutige Aussage, welches Allel vorliegt.

Mittels allelspezifischer PCR kann man die Mutationsrate in einem Pool oder Hintergrund von Wildtyp-Sequenzen quantifizieren. Auch die Überprüfung von Mutationshäufigkeiten, die durch NGS bestimmt wurden, kann mittels allelspezifischer PCR und SNP Pol DNA-Polymerase verifiziert werden. Damit bietet die SNP Pol DNA-Polymerase für die Humanmedizin, Lebensmittel- und Pflanzenbiotechnologie ein hervorragendes Mittel der Wahl.

Sehr gut geeignet ist die SNP PolTaq DNA-Polymerase zur Analyse von Liquid Biopsie Proben. Mit ihr kann die Anwesenheit und Häufigkeit von Krebsmutationen sehr gut analysiert und quantifiziert werden. Die Variante SNP PolTaq DNA-Polymerase besitzt 5'-3'-Nuklease Aktivität und kann daher mit spezifischen Primersonden wie Taqman® Sonden oder Molecular beacons eingesetzt werden.

Anwendungsgebiete für die SNP Pol DNA-Polymerase

- Überwachung, Prüfung und Nachweis von Punktmutationen
- Identifizierung von korrekten oder falschen CRISPR/Cas9-Produkten
- Prüfung und Bestätigung von Sequenzierergebnissen
- Quantifizierung von Mutationen (z.B. NG-Ergebnisse)
- SNP-Detektion bei allelspezifischer Amplifikation (ASA) / allelspezifischer PCR
- Methylierungsspezifische PCRs (MSP) nach Bisulfitbehandlung der DNA (CpG Methylierungsstellen)
- HLA-Genotypisierung
- Multiplex-PCR
- realtime PCR mittels Hydrolysesonden
- realtime Multiplex-PCR
- allelspezifische PCR (ASA, AS-PCR)
- allelspezifische Primer Extension (AS-PEX)

Literatur:

- DamID-seq data in C. elegans / Sharma R, Ritler D, Meister P.
- Minisequencing SNP genotyping with SNPase DNA Polymerase / Lovmar L, Fredriksson M, Liljedahl U, Sigurdsson S, Syvänen AC
- Allele specific mismatch selectivity by the HiDi DNA polymerase / Drum M, Kranaster R, Ewald C, Blasczyk R, Marx A