Trojanische Pferde mit klinischem und therapeutischem Potential

Was sind CPPs?

CPPs sind zellpenetrierende Peptide von unterschiedlicher Größe, Aminosäuresequenz und Ladung, sind aber im Normalfall 5 - 30 Aminosäuren lang. Alle CPPs haben die Fähigkeit, Zellmembranen zu durchdringen und können auf diese Weise helfen, bioaktive Substanzen in eine Zelle (Zytoplasma, Organelle, Zellkern) zu schleußen [1]. Über den genauen Mechanismus des Transports durch die Zellmembran gibt es keinen Konsens, es lassen sich aber drei Mechanismen definieren:
1. direkte Durchdringung der Zellmembran
2. Endozytose-vermittelter Eintritt
3. Translokation durch Bildung einer Übergangsstruktur.

Die CPP-Transduktion ist noch ein Forschungsbereich, findet aber schon Anwendung z.B. bei einigen Transfektionsmedien.
Wie andere Vektoren, z.B. Polyplexe, Liposomen, Goldpartikel oder gentechnisch synthetisierte Viren und Bakterien, können CPPs Nukleinsäuren, kleine Moleküle, Medikamente, monoklonale Antikörper und Proteine in Zellen einschleußen. Was sie jedoch von den anderen Substanzen/Methoden unterscheidet, ist ihre einzigartige chemische Struktur und die Leichtigkeit, mit der vorhandene Seitengruppen modifiziert und für spezielle Anwendungen optimiert werden können. Diese Eigenschaften ermöglichen eine weitaus größere Auswahlmöglichkeit bzw. einen gezielten Einsatz, um Wirksubstanzen in den gewünschten Zelltyp transportieren zu können, als dies mit den anderen Methoden auch nur Ansatzweise möglich wäre [3]. Desweiteren können mit der Modifikation bestehender CPPs die Aufnahmeeffizienz und Stoffwechselstabilität verbessert/vergrößert werden. So waren CPPs die ersten Transportmoleküle, mit denen bildgebende Substanzen in Zielzellen gebracht werden konnten, was dazu geführt hat, dass es mehr und mehr Studien zu ihrem potenziellen Einsatz für klinische und therapeutische Ansätze gibt [2].

Die ersten entdeckten CPPs

Das erste natürlich vorkommende CPP, das identifiziert und charakterisiert wurde, war das 12-Aminosäure-Transaktivator Transkription (TAT) Peptid >, das im Genom des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) kodiert ist. Es wurde beobachtet, dass TAT die Plasmamembran von kultivierten Zellen durchdringt und in den Zellkern transloziert, wo es die Genexpression des Virus trans-aktiviert [7, 8]. Später, 1991, wurde ein 16-Aminosäuren-Peptid gefunden, das in der dritten Helix der Antennapedia-Homöodomäne von Drosophila melanogaster kodiert ist. Dieses kleine Peptid war notwendig und ausreichend, um Moleküle durch Zellmembranen zu transportieren, wobei ein energieunabhängiger Mechanismus verwendet wurde, der nicht durch Endozytose vermittelt wurde [ 9]. Während CPPs weiterhin aus natürlich vorkommenden Proteinen und chimären Peptiden gewonnen werden, können ihre Analoga in vitro synthetisiert werden. Wo es kein natürliches Gegenstück gibt, kann ein CPP in silico entworfen und in vitro synthetisiert und getestet werden.

Klassifizierung von CCPs

CPPs wurden klassifiziert nach (i) ihren physikochemischen Eigenschaften, (ii) ihrem Ursprung oder (iii) ihrer Fähigkeit, die Kernmembran anzusteuern und zu durchdringen. Bei den sogenannten Nuclear Localization Sequences (NLS) handelt es sich um kurze, kationische CPPs, die Polylysin-, Arginin- oder Prolinmotive enthalten. Dabei wandert der NLS-Teil durch die Kernpore, einen multimeren Komplex, der 50-100 Proteine enthält, in den Kern ein [1].

Tabelle 1 listet einige CPPs auf, die bisher experimentell untersucht worden sind. Eine ausführliche Liste kann unter
„CPPsite 2.0-Datenbank für zellpenetrierende Peptide“ (http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.html) [10] eingesehen werden. Diese und andere Quellen aus der Fachliteratur bieten detaillierte Informationen zu mehr als 1.700 experimentell untersuchten CPPs.

Wie durchdringen CPPs Zellmembranen?

Einfach gesagt, verleiben sich Zellen CPPs und ihre Beladung durch (i) Endozytose, einen energieabhängigen Mechanismus, (ii) direkte Translokation oder einen energieunabhängigen Mechanismus ein. Welcher Mechanismus verwendet wird, wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, wie z. B. die CPP-Sequenz, die Konformation der CPPs, deren Nettoladung, die Temperatur, die chemische Zusammensetzung und Ladung der Lipidmembran der Zelle, sowie die Größe und die chemische Zusammensetzung der transportierten Substanz und wie diese Substanz mit dem CPP konjugiert ist.

- Endozytose - Die Endozytose bioaktiver Moleküle erfolgt entweder durch Phagozytose (Aufnahme großer Makromoleküle) oder durch Pinozytose (Aufnahme von Flüssigkeiten und gelösten Stoffen). Während die Phagozytose auf zwei spezialisierte Zelltypen des Immunsystems, Makrophagen und Leukozyten, kommt die Pinozytose in jeder Zelle vor und umfasst vier verschiedene Arten von Aufnahmemechanismen: (i) Macropinozytose, (ii) Clathrin-abhängige, (ii) Caveolin-abhängige oder (iii) Clathrin- und Caveolin-unabhängige endocytischer Weg [11].

- Direkte Translokation - Alle Zellen haben die Möglichkeit, CPPs und ihre Ladung durch verschiedene energieunabhängige Mechanismen aufzunehmen, das sind (i) Porenbildung [12], (ii) teppichartige Internalisierung [13], (iii) Membranverdünnung [ 14] oder (iv) invertierte Mizellenbildung [15]. In jedem Fall wird die Aufnahme der CPPs durch Membranwechselwirkung, gefolgt von Membranpermeation, initiiert und endet mit der Freisetzung des CPP und seiner Ladung in das Cytosol (siehe: http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite1/help.php #helppage).

TABLE 1 – CPPs and their classification

Basis for Classification

Type of CPP

Name of CPP

Sequence

Refs

PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES

CATIONIC

HIV-1 TAT48-60 >

GRKKRRQRRRPQ

7, 8

Penetratin [pAntp43-58] >

RQIKIWFQNRRMKWKK

16

AMPHIPATHIC

Transportan

GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL

17

kalata B1 (cysteine knot cyclic peptide)

CGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNGLPV

18

Pep-1

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV

2

HYDROPHOBIC

Pept 1

PLILLRLLRGQF

2

Pept 2

PLIYLRLLRGQF

2

IVV-14

KLWMRWYSPTTRRYG

2

ORIGIN

CHIMERIC

Transportan

GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL

17

Ig(v)

MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV

2

SYNTHETIC

Amphiphilic model peptide

KLALKLALKALKAALKLA

2

PROTEIN-DERIVED

pVEC

LLIILRRRIRKQAHAHSK

2

HRSV

RRIPNRRPRR

2

HIV-1 TAT48-60 >

GRKKRRQRRRPQ

7, 8

Penetratin   [pAntp43-58]

RQIKIWFQNRRMKWKK

16

OTHER

NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCES (NLS)

SV40 T-antigen NLS (Monopartite)

PKKKRKV

19

Nucleoplasmin (Bipartite)

KRPAATKKAGQAKKKL

20

NF-Kb

VQRKRQKLMP

1, 21

TFIIE-beta

SKKKKTKV

1, 21

Oct-6

GRKRKKRT

1, 21

HATF-3

ERKKRRRE

1, 21

SDC3

FKKFRKF

1, 21

 

Therapeutische Anwendungen von CPPs und bestehende Hindernisse für ihre klinische Anwendung

CPPs gehören zu den effizientesten und effektivsten Vektoren zum Transport bioaktiver Moleküle, die bisher getestet worden sind, wodurch sie attraktive Kandidaten für die Verwendung in der klinischen und therapeutischen Biomedizin sind. Präklinische Studien zeigen, dass sie die Blut-Hirn-Schranke, die Darmschleimhaut, die Nasenschleimhaut und die Haut durchqueren können [22]. Daneben haben CPPs in einer Reihe experimenteller Modelle therapeutischen Nutzen gezeigt, darunter akute Cochlea-Verletzungen [23], Wehen, Multiple Sklerose, Krebs, chronische Schmerzen, Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf-Erkrankungen [18].
 Vorklinische Experimente zeigen aber auch tatsächliche und potenzielle Hindernisse für die klinische Anwendung. Einige davon sind in Tabelle 2 zusammen mit möglichen Ansätzen zur Überwindung der zugrunde liegenden Probleme aufgeführt.

 TABLE 2 - Potential Obstacles To The Clinical Usefulness Of CPPs And Their Solutions

OBSTACLE

SOLUTION

REFS

 

LACK OF CELL TYPE SPECIFICITY

1. Design dormant CPP that cannot penetrate cell plasma membrane (e.g. fusion peptide; side-chain modification).  2. Activate CPP by external trigger (e.g. Δ pH; Δ temp.; UV exposure; proteolysis).

6, 24, 25, 26, 27

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

POOR TRANSDUCIBILITY (Problem with CPP)

Consider physico-chemical properties of CPP:

. Guanidinium content

. Hydrophobicity

. Amphipathicity

. Charge

. Chirality (L- and D- combinations)

. Secondary structure

. Folding capacity in the presence of membranes

. Affinity of CPP for membranes

 

Possible modifications to CPP scaffold:

. Use of cell-penetrating polydisulfides

. Alpha vs beta helices; cyclization via triazole bridge; reversible bicyclization via paired S-S bonds

. N-alkylated proline spacers in-between R residues in Arginine-rich CPPs (R-X-R).

. Diketopiperazine-based oligo peptide.

. Gamma-aminoproline-based hexapeptide

. Octapeptides

. Filamentous CPPs

. Triple helical CPPs

. Supramolecular CPPs based on intermolecular interaction of repeating units

. Tryptophan-rich CPPs that assemble into spherical aggregates

6, 28, 29, 30, 31, 32

 

 

METHOD OF CONJUGATION Vs TRANSDUCTION EFFICIENCY (Problem with CPP/linker/cargo)

1. Covalent conjugation:

. Chemical (disulphide bonds, amine bonds, specific linkers).

. Expression host (E. coli or S. cerevisiae) produces the CPP-cargo conjugate.

2. Reversible, non-covalent coupling:

. Calmodulin plus calmodulin-binding motif.

. EF hand adaptor proteins (calmodulin-like protein 3 (CALML3), troponin).

2. Physical complexation

. Electrostatic and/or hydrophobic interactions between CPP and its cargo, achieved by simple bulk-mixing.

33, 34

 

 

 

ENDOSOMAL ENTRAPMENT OF CPP & CARGO

1. Direct CPP and its cargo to cytosol instead of endosomes:

. Cyclization of CPP

. Arginine-rich CPP plus fusogenic lipids, membrane-disruptive peptides, membrane-disruptive polymers, lysosomotropic agents, photochemical internalization.

. PolyArginine CPP fused to the translocation domain of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.

2. Incorporate subcellular targeting sequences into CPP backbone.

4, 5, 6, 35

POTENTIAL CYTOTOXICITY

 

. Affecting cell and organelle membranes

 

. Resulting from specific interactions between CPP and cell components

1. Measure cell membrane integrity as an indirect indicator of cytotoxicity:

. Trypan Blue exclusion

. MTT assay

. Fluorescein leakage

. 2-deoxyglucose-6-phosphate leakage

 

2. Test whether peptide concentration, cargo molecule or coupling strategy is the likely cause of cytotoxicity.

36, 37

 

SUSCEPTIBILITY TO PROTEOLYTIC DEGRADATION

1. Modify backbone (e.g. adjust length; test different alpha > beta peptide substitutions).

2. Introduce chirality (L- and D- combinations).

3. Cyclization (e.g. via triazole bridge).

4. Reversible bicyclization (paired S-S bonds).

28, 29, 30, 31, 32

UNFAVORABLE PHARMACOKINETICS & UNCLEAR INTERNALIZATION PATHWAYS

1. Incorporate targeting sequences into CPP sequence

2. Synthesise activatable CPPs.

3. Adjust MW.

4. Test different routes of administration (nasal, pulmonary, transdermal delivery).

5

 

 

 

METHOD OF CONJUGATION Vs TRANSDUCTION EFFICIENCY

1. Covalent conjugation:

. Chemical (disulphide bonds, amine bonds, specific linkers)

. Expression host (E. coli or S. cerevisiae) produces the CPP-cargo conjugate

2. Reversible, non-covalent coupling:

. Calmodulin plus calmodulin-binding motif

. EF hand adaptor proteins (calmodulin-like protein 3 (CALML3), troponin)

2. Physical complexation

. Electrostatic and/or hydrophobic interactions between CPP and its cargo, achieved by simple bulk-mixing

33, 34

 Abschließende Bemerkungen

CPPs bieten aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer vielseitigen Struktur sowie Modifikationsmöglichkeiten vielversprechende Ansätze, als Vehikel für den gezielten Transport bioaktiver Moleküle in subzelluläre Kompartimente zu dienen. Speziell von Substanzen, die mit anderen Mitteln weder präzise noch effizient noch mit einer akzeptablen Toxizität in Zellen eingeschleußt werden können.
Die andauernden Anstrengungen, die noch vorhandenen Probleme bei der Verwendung von CPPs zu beseitigen, sollten den Weg ebnen, CPPs zur maßgeschneiderten Behandlung einer Reihe von Krankheiten und Beschwerden einsetzen zu können.

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References

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