INNOVATIONEN IN NICHT-VIRALER BEREITSTELLUNG UND ZIELSPEZIFITÄT DER CRISPR / Cas9-GENE EDITING-TECHNOLOGIE

INNOVATIONEN IN NICHT-VIRALER BEREITSTELLUNG UND ZIELSPEZIFITÄT DER CRISPR / Cas9-GENE EDITING-TECHNOLOGIE

Durch die Entdeckung von CRISPR/Cas-Nukleasen in E. coli konnte eine Gensuperfamilie entdeckt werden, die sich in Archaeen und Bakterien als eine Form der erworbenen Immunität gegen wiederholte Virusinfektion und Plasmidtransfektion entwickelte [1, 2]. Die Anpassungsfähigkeit dieses Systems als Geneditierungsinstrument in eukaryotischen Zellen [3, 4] hat das Potenzial von CRISPR / Cas-Nukleasen unterstrichen, das auf Nukleinsäuren basierende Genom einer beliebigen Spezies an einem einzelnen oder mehreren Loci zu modifizieren, je nach Target als DNA, mRNA oder als Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex [5]. Während diese Eigenschaften die kollektive Vorstellungskraft von Wissenschaftlern angeregt haben, stellt sie die CRISPR / Cas-Gentechnologie auch vor große Herausforderungen.Im Falle der CRISPR / Cas9-Nuklease hängt die erfolgreiche Bearbeitung von eukaryotischen Genen nicht nur von der Wahl des Zellziels und seines Genotyps vor einer Mutation bzw. des Phänotyps ab, sondern auch von den folgenden Überlegungen:

  • Die Wahl des Vektors (d.h. Virus oder Nicht-Virus), der eine effiziente und gezielte Abgabe seiner Tragfähigkeit unter Berücksichtigung des Kontexts (d.h. in vitro oder in vivo) gewährleistet.
  • Design und experimentelle Validierung der Gen-Editing-Komponenten.
  • Das Format der CRISPR / Cas9-Ladung (d.h. Nukleinsäure oder Ribonukleoprotein (RNP)).
  • Die Möglichkeit, dass eine unkontrollierte Geneditierungsaktivität innerhalb des beabsichtigten Ziels auftritt, führt zu unmittelbaren / latenten unbeabsichtigten Auswirkungen der Mutation.
  • Risiken von dosis- oder vektor- oder genbedingter Onkogenese, Toxizität, Zytotoxizität oder Immunogenität.
  • Das Risiko, dass die CRISPR / Cas9-Maschinerie in Exosomen abgefangen / abgebaut wird, was die Abgabe an den Zielort (Loci) verhindert.
  • Das Design der Protokolle zur postmutationalen Analyse von Genotyp und Phänotyp.
  • Eine Strategie zur Identifizierung des Phänotyps, die auf off-target-Mutationen zurückgeführt werden können.

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Hier konzentrieren wir uns auf zwei Ansätze für das sichere und effiziente Design und die Bereitstellung der CRISPR / Cas9-Gentechnologie:

1. Die Entwicklung von Alternativen zur virusvermittelten Verabreichung von CRISPR / Cas9 in vitro und in vivo und

2. Innovationen, die in die CRISPR / Cas9-Maschinerie selbst integriert wurden, um ihre Zielspezifität und Wirksamkeit zu verbessern.

1. Aktuelle und künftige Alternativen zur virusvermittelten Bereitstellung von CRISPR / Cas9

Es gibt viele Berichte über eine erfolgreiche Krankheitsbehandlung durch virusvermittelte Abgabe modifizierender Gene [6, 7]. Die Popularität der Integration und Nicht-Integration von Virusvektoren hat jedoch abgenommen. Dies kann daran liegen, dass (i) sie ihre genetische Tragfähigkeit nicht zuverlässig an ihr Ziel liefern, (ii) es eine Obergrenze für die Größe der Nukleinsäureladung gibt, die in das Virusgenom eingefügt werden kann, (iii) Die Produktion von Virusvektoren im großen Maßstab schwierig ist; und (iv) das Virus selbst trägt ein echtes Risiko, neoplastische Transformation, Immunogenität, Zytotoxizität oder Toxizität zu verursachen [5, 8, 9].

Verschiedene bemerkenswerte Alternativen zur virusvermittelten Bereitstellung von CRISPR / Cas9 befinden sich in der Entwicklung:

Anwendungen, die für die In-vivo-Anwendung vorgesehen sind, umfassen: (i) Lipid-Nanopartikel-vermittelte Bereitstellung von Cas9-mRNA in Kombination mit Adeno-assoziierten Viren (AAV), die für eine sgRNA und ein Reparatur-Template kodieren [9], (ii) gemeinsame Bereitstellung eines Cas9-Proteins: sgRNA: Lipofectaminkomplex, der auf ein PolyDOPA-Melanin-Gerüst geimpft ist und eine lokalisierte und anhaltende Bearbeitung in vivo ermöglichen soll, die bei der Geweberegeneration nützlich sein könnte [10], und (iii) eine verbesserte Bearbeitung des Genoms über die oviduktale Nukleinsäureabgabe, (i-GONAD) [11, 12], das für Knock-In-, Knock-Out- und Large-Deletion-Mutationen sorgt und ein Kandidat für die Korrektur von Keimbahnmutationen in vivo ist, da die CRISPR / Cas9-Maschinerie bereits vor der Implantation des Embryos eingeführt wurde

Zu den Anwendungen, die in vivo oder in vitro verwendet werden sollen, gehören: (iv) gleichzeitige Bereitstellung von Cas9-mRNA und -sgRNA in Tricarboxamid-Lipid-ähnlichen Nanopartikeln [13] oder (v) in zwitterionischen Aminolipid-Nanopartikeln (ZNPs) [14] oder (vi) gemeinsame Bereitstellung von Cas9-Protein und sgRNA unter Verwendung eines amphipathischen „Endo-Porter“ (EP) -Peptids [15].

In-vitro-Anwendungen umfassen: (vii) die gemeinsame Bereitstellung von Cas9-Protein und sgRNA innerhalb von Exosom-Liposom-Hybrid-Nanopartikeln [16], (viii) die direkte zytosolische Bereitstellung von mit sgRNA komplexiertem Cas9-Protein in Gold-Nanopartikeln [17], (ix) CRISPR Cas9-RNP-vermittelte Geneditierung durch Röhrenelektroporation [18] und (x) Co-Mikroinjektion von Cas9-mRNA und -sgRNAs in 1-Zell-Embryonen [19, 20].

2. Innovationen für die CRISPR / Cas9-Ribonukleoprotein-Maschinerie

In Verbindung mit der Entwicklung von Nicht-Virus-Vektoren wurden Innovationen im Design des CRISPR / Cas9-Komplexes entwickelt, die sowohl die Nicht-Spezifität des Ziels als auch die anhaltende Nukleaseaktivität reduzieren sollen.Erstens handelt es sich um ein „Kamikaze“ CRISPR / Cas9-System [21], das einen AAV2-Vektor (Adeno-Associated Virus) verwendet, um das Streptococcus pyogenes Cas9-Gen (SpCas9) und die sgRNAs in vivo gemeinsam zu übertragen und sicherzustellen, dass die SpCas9-Nuklease degradiert und das Zielgen gestört wird.

Die zweite Neuerung ist die Entwicklung einer High-Fidelity-Variante von SpCas9, die modifiziert wurde, um unspezifische DNA-Kontakte zu reduzieren [22].

3. Abschließende Bemerkungen

Die oben beschriebenen Innovationen sind nur einige der jüngsten Versuche, die CRISPR / Cas9-Technologie in Richtung klinischer Translation voranzutreiben. Ziel ist es, das Risiko von unbeabsichtigten Indels, anhaltender oder eingeschränkter Expression von Cas9, dosisabhängiger Toxizität, Zytotoxizität, Immunogenität, exosomalem Einschluss und vorzeitigem Abbau der CRISPR / Cas9-Maschinerie zu verringern oder zu beseitigen und sicherzustellen, dass das transportierte Produkt stabil, effektiv und für die Zielgruppe (n) zugänglich bleibt.

REFERENZEN 

 1. ISHINO, Y, SHINAGAWA, H, MAKINO, K, et al. “Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product”. J Bacteriol 1987; 169(12): 5429-5433.

 2.RATH, D, AMLINGER, L, RATH, A, et al. “The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications”. Biochimie 2015; 117: 119-128.

 3. JINEK, M, CHYLINSKI, K, FONFARA, I, et al. “A programmable dual-RNA-guided endonuclease in adaptive bacterial immunity”.  Science 2012; 337(6096): 816-821.

 4. CONG, L, RAN, FA, COX, D, et al. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems”. Science 2013; 339(6121): 819-823.

 5.LI, L, HU, S & CHEN, X. “Non-viral delivery systems for CRISPR/Cas9-based genome editing: challenges and opportunities”. Biomaterials 2018; 171: 207-218.

 6. CRIBBS, AP & PERERA, SMW. “Science and bioethics of CRISPR-Cas9 gene editing: an analysis towards separating facts and fiction”. Yale J Biol Med 2017; 90: 625-634.

7. FINER, M & GLORIOSO, J. “A brief account of viral vectors and their promise for gene therapy”. Gene Ther 2017; 24(1): 1-2.

8. THOMAS, CE, EHRHARDT, A, & KAY, MA. “Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy”. Nat Rev Genet 2003; 4(5): 346-358.

9. YIN, H, SONG, C-Q, DORKIN, JR, et al. “Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo”. Nat Biotechnol 2016; 34(3): 328-333.

10. CHIN, JS, CHOOI, WH, WANG, H, et al. “Scaffold-mediated non-viral delivery platform for CRISPR/Cas9-based genome editing”. Acta Biomater 2019; 90: 60-70.

11. GURUMURTHY, CB, SATO, M, NAKAMURA, A, et al. “Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD”. Nat Protoc 2019; 14(8): 2452-2482.

12. OHTSUKA, M & SATO, M. “i-GONAD: a method for generating genome-edited animals without ex vivo handling of embryos”. Dev Growth Differ 2019; 61(5): 306-315.

13. JIANG, C, MEI, M, LI, B, et al. “A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutically targeting HBV DNA and pcsk9 in vivo”. Cell Res 2017; 27(3): 440-443.

14. MILLER, JB, ZHANG, S, KOS, P, et al. “Non-viral CRISPR/Cas gene editing in vitro and in vivo enabled by synthetic nanoparticle co-delivery of Cas9 mRNA and sgRNA”.  Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56(4): 1059-1063.

15. SHEN, Y, COHEN, JL, NICOLORO, SM, et al. “CRISPR-delivery particles targeting nuclear receptor-interacting protein 1 (Nrip1) in adipose cells to enhance energy expenditure”. J Biol Chem 2018; 293: 17291-17305.

16. LIN, Y, WU, J, GU, W, et al. “Exosome-liposome hybrid nanoparticles deliver CRISPR/Cas9 system in MSCs”. Adv Sci 2018; 5: 1700611.

17. MOUT, R, RAY, M, TONGA, GY, et al. “Direct cytosolic delivery of CRISPR/Cas9-ribonucleoprotein for efficient gene editing”. ACS Nano 2017; 11(3): 2452-2458.

18. MA, L, JANG, L, CHEN, J, et al. “CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation”. J Vis Exp 2019; (148): e59512; doi: 10.3791/59512.

19. HE, Z-Y, MEN, K, YANG, Y, et al. “Non-viral and viral delivery systems for CRISPR-Cas9 technology in the biomedical field”. Sci China Life Sci 2017; 60(5): 458-467.

20. ZHANG, T, YIN, Y, LIU, H, et al. “Generation of VDR knock-out mice via zygote injection of CRISPR/Cas9 system”. PLoS ONE 2016; 11(9): e0163551.

21. LI, F, HUNG, SSC, MOHD KHALID, MKN, et al. “Utility of self-destructing CRISPR/Cas constructs for targeted gene editing in the retina”. Hum Gene Ther 2019; doi: 10.1089/hum.2019.021.

22. KLEINSTIVER, BP, PATTANAYAK, V, PREW, MS, et al. ”High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects”. Nature 2016; 529(7587): 490-495.

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