DIGITALE PCR (dPCR)
Mit Hilfe der dPCR oder digitalen PCR erfolgt digital eine absolute Messung von Nukleinsäuren, ohne eine exponentielle Amplifikation der DNA vorzunehmen. Dabei werden im Gegensatz zur herkömmlichen Realtime PCR (qPCR) keine Standardkurven, Berechnung eines Ct-Wertes oder Referenzen benötigt, da nur ein einzelner Amplifikationsschritt durchgeführt wird, um eine Ja/Nein Antwort zu erhalten. Bei der dPCR werden ähnliche Reagenzien wie bei der Standard PCR verwendet Es wird die absolute Anzahl an individuellen Zielmolekülen gezählt.
Bei der dPCR werden zunächst die vorhandene DNA- oder cDNA-Probe in eine große Anzahl parallel laufender, einzelner PCR-Reaktionen aufgetrennt. Je größer die Anzahl an einzelnen Reaktionen ist, desto präziser ist das Ergebnis der Auswertung (High-Throughput-Screening). Dabei ist das ursprüngliche Probenvolumen derart stark in einzelne „Gefäße“ aufgetrennt (äußerst geringes Volumen im Bereich von Femtolitern), dass idealerweise maximal ein einzelnes Molekül pro „Reaktionsgefäß“ enthalten ist.
Einige dieser PCR-Reaktionen enthalten so die zu identifizierende Zielsequenz, andere nicht. In diesen wird bei der folgenden, nur einen Amplifikationszyklus umfassenden PCR kein Signal produziert. Die Auswertung erfolgt daher zunächst nach dem Ja-oder-Nein-Prinzip. Daraufhin wird das Verhältnis von positiven zu negativen Proben ermittelt.
Dabei sind keine Standards oder endogenen Kontrollen notwendig.
Durch die Beschränkung auf einen einzelnen Amplifikationszyklus werden Varianzen vermieden (keine Beschränkung durch Verbrauch der Chemie, gerätebasierte Unregelmäßigkeiten oder rechnerischer Natur (exponentielle Funktion, Ct-Wert)) bei einer gleichzeitig hohen Nachweisgrenze.
Zur Detektion werden wie in der herkömmlichen qPCR mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Sonden verwendet.
Eine mögliche Fehlerquelle in der Auswertung besteht darin, dass mehrere Zielmoleküle pro Reaktionsgefäß enthalten sind. Dies wird durch einen statistischen Poisson Algorithmus in den Geräten ausgeglichen.
Anwendungen mit der dPCR
- Absolute Quantifizierung von Proben, z.b. Diagnostik von Pathogenen
- Detektion von selten vorkommenden Allelen und Mutationen
- Absolute Quantifizierung von Nukleinsäurestandards
- Absolute Quantifizierung von Next Generation Sequencing-Bibliotheken
- Absolute Quantifizierung der Genexpression
- Absolute Quantifizierung von Referenzstandards für die qPCR
Vorteile der dPCR
- Die dPCR ist sehr tolerant gegenüber Inhibitoren
- Die Sample-Präparation ist gleich wie bei der qPCR
- Kleinere Variationen können höchst genau bestimmt werden
- Hohe Reproduzierbarkeit und hohe Präzision
Die Analyse der miRNA-Expression bei der Stammzellendifferenzierung wurde von Jiang et al. beschrieben (Jiang, K., Ren, C., & Nair, V. (2013). MicroRNA-137 represses Klf4 and Tbx3 during differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research, 11(3) 1299-1313).
Die dPCR stößt auf immer größeres Interesse in den Bereichen Krebsmutationen, zirkulierende RNA und DNA zum Beispiel bei Krebspatienten oder Detektion seltener Ereignisse, z.B. können mutierte Sequenzen vor einem hohen Hintergrund an Wildtyp-Sequenzen sehr spezifisch erkannt werden. Somatische Mutationen können aufgrund der hohen Selektivität der dPCR gezielt detektiert werden. Für Patienten ergibt sich dadurch die Chance auf eine frühere, minimalinvasive Diagnose. Der Nachweis seltener Allele oder Mutationen ist ein weiterer Vorteil. Komplexe Mischungen können ebenfalls analysiert werden.
Ein anderes Einsatzgebiet ist die Bestimmung von transgenen Kopienvariationen, die mit herkömmlicher Realtime PCR nur schlecht erfasst werden können.
Fazit:
qPCR: viele Proben mit geringem Arbeitsaufwand, relative Messung. Quantifizierung nur gegenüber Referenzstandard möglich.
dPCR: absolute Messung von Nukleinsäuren, keine cycle Threshold (Ct) notwendig wie bei qPCR. Mit ihrer Hilfe können sensitiv und schnell eine begrenzte, jedoch relevante Anzahl von Genen einer größeren Population untersucht werden.
Wenn der gesamte Satz geteilter Reaktionen gezählt wird, ist die Gesamtzahl der "positiven" Reaktionen gleich der Anzahl der ursprünglichen Zielmoleküle im gesamten Volumen, und die Gesamtzahl der Reaktionen, multipliziert mit dem individuellen Reaktionsvolumen, ist gleich dem Gesamtvolumen, das untersucht wird. Somit kann die absolute Konzentration des Ziels leicht berechnet werden als gleich der Gesamtzahl der Zielmoleküle geteilt durch das gesamte gemessene Volumen.
