INNOVATIONEN IN NICHT-VIRALER BEREITSTELLUNG UND ZIELSPEZIFITÄT DER CRISPR / Cas9-GENE EDITING-TECHNOLOGIE
Durch die Entdeckung von CRISPR/Cas-Nukleasen in E. coli konnte eine Gensuperfamilie entdeckt werden, die sich in Archaeen und Bakterien als eine Form der erworbenen Immunität gegen wiederholte Virusinfektion und Plasmidtransfektion entwickelte [1, 2]. Die Anpassungsfähigkeit dieses Systems als Geneditierungsinstrument in eukaryotischen Zellen [3, 4] hat das Potenzial von CRISPR / Cas-Nukleasen unterstrichen, das auf Nukleinsäuren basierende Genom einer beliebigen Spezies an einem einzelnen oder mehreren Loci zu modifizieren, je nach Target als DNA, mRNA oder als Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex [5]. Während diese Eigenschaften die kollektive Vorstellungskraft von Wissenschaftlern angeregt haben, stellt sie die CRISPR / Cas-Gentechnologie auch vor große Herausforderungen.Im Falle der CRISPR / Cas9-Nuklease hängt die erfolgreiche Bearbeitung von eukaryotischen Genen nicht nur von der Wahl des Zellziels und seines Genotyps vor einer Mutation bzw. des Phänotyps ab, sondern auch von den folgenden Überlegungen:
- Die Wahl des Vektors (d.h. Virus oder Nicht-Virus), der eine effiziente und gezielte Abgabe seiner Tragfähigkeit unter Berücksichtigung des Kontexts (d.h. in vitro oder in vivo) gewährleistet.
- Design und experimentelle Validierung der Gen-Editing-Komponenten.
- Das Format der CRISPR / Cas9-Ladung (d.h. Nukleinsäure oder Ribonukleoprotein (RNP)).
- Die Möglichkeit, dass eine unkontrollierte Geneditierungsaktivität innerhalb des beabsichtigten Ziels auftritt, führt zu unmittelbaren / latenten unbeabsichtigten Auswirkungen der Mutation.
- Risiken von dosis- oder vektor- oder genbedingter Onkogenese, Toxizität, Zytotoxizität oder Immunogenität.
- Das Risiko, dass die CRISPR / Cas9-Maschinerie in Exosomen abgefangen / abgebaut wird, was die Abgabe an den Zielort (Loci) verhindert.
- Das Design der Protokolle zur postmutationalen Analyse von Genotyp und Phänotyp.
- Eine Strategie zur Identifizierung des Phänotyps, die auf off-target-Mutationen zurückgeführt werden können.
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Hier konzentrieren wir uns auf zwei Ansätze für das sichere und effiziente Design und die Bereitstellung der CRISPR / Cas9-Gentechnologie:
1. Die Entwicklung von Alternativen zur virusvermittelten Verabreichung von CRISPR / Cas9 in vitro und in vivo und
2. Innovationen, die in die CRISPR / Cas9-Maschinerie selbst integriert wurden, um ihre Zielspezifität und Wirksamkeit zu verbessern.
1. Aktuelle und künftige Alternativen zur virusvermittelten Bereitstellung von CRISPR / Cas9
Es gibt viele Berichte über eine erfolgreiche Krankheitsbehandlung durch virusvermittelte Abgabe modifizierender Gene [6, 7]. Die Popularität der Integration und Nicht-Integration von Virusvektoren hat jedoch abgenommen. Dies kann daran liegen, dass (i) sie ihre genetische Tragfähigkeit nicht zuverlässig an ihr Ziel liefern, (ii) es eine Obergrenze für die Größe der Nukleinsäureladung gibt, die in das Virusgenom eingefügt werden kann, (iii) Die Produktion von Virusvektoren im großen Maßstab schwierig ist; und (iv) das Virus selbst trägt ein echtes Risiko, neoplastische Transformation, Immunogenität, Zytotoxizität oder Toxizität zu verursachen [5, 8, 9].
Verschiedene bemerkenswerte Alternativen zur virusvermittelten Bereitstellung von CRISPR / Cas9 befinden sich in der Entwicklung:
Anwendungen, die für die In-vivo-Anwendung vorgesehen sind, umfassen: (i) Lipid-Nanopartikel-vermittelte Bereitstellung von Cas9-mRNA in Kombination mit Adeno-assoziierten Viren (AAV), die für eine sgRNA und ein Reparatur-Template kodieren [9], (ii) gemeinsame Bereitstellung eines Cas9-Proteins: sgRNA: Lipofectaminkomplex, der auf ein PolyDOPA-Melanin-Gerüst geimpft ist und eine lokalisierte und anhaltende Bearbeitung in vivo ermöglichen soll, die bei der Geweberegeneration nützlich sein könnte [10], und (iii) eine verbesserte Bearbeitung des Genoms über die oviduktale Nukleinsäureabgabe, (i-GONAD) [11, 12], das für Knock-In-, Knock-Out- und Large-Deletion-Mutationen sorgt und ein Kandidat für die Korrektur von Keimbahnmutationen in vivo ist, da die CRISPR / Cas9-Maschinerie bereits vor der Implantation des Embryos eingeführt wurde
Zu den Anwendungen, die in vivo oder in vitro verwendet werden sollen, gehören: (iv) gleichzeitige Bereitstellung von Cas9-mRNA und -sgRNA in Tricarboxamid-Lipid-ähnlichen Nanopartikeln [13] oder (v) in zwitterionischen Aminolipid-Nanopartikeln (ZNPs) [14] oder (vi) gemeinsame Bereitstellung von Cas9-Protein und sgRNA unter Verwendung eines amphipathischen „Endo-Porter“ (EP) -Peptids [15].
In-vitro-Anwendungen umfassen: (vii) die gemeinsame Bereitstellung von Cas9-Protein und sgRNA innerhalb von Exosom-Liposom-Hybrid-Nanopartikeln [16], (viii) die direkte zytosolische Bereitstellung von mit sgRNA komplexiertem Cas9-Protein in Gold-Nanopartikeln [17], (ix) CRISPR Cas9-RNP-vermittelte Geneditierung durch Röhrenelektroporation [18] und (x) Co-Mikroinjektion von Cas9-mRNA und -sgRNAs in 1-Zell-Embryonen [19, 20].
2. Innovationen für die CRISPR / Cas9-Ribonukleoprotein-Maschinerie
In Verbindung mit der Entwicklung von Nicht-Virus-Vektoren wurden Innovationen im Design des CRISPR / Cas9-Komplexes entwickelt, die sowohl die Nicht-Spezifität des Ziels als auch die anhaltende Nukleaseaktivität reduzieren sollen.Erstens handelt es sich um ein „Kamikaze“ CRISPR / Cas9-System [21], das einen AAV2-Vektor (Adeno-Associated Virus) verwendet, um das Streptococcus pyogenes Cas9-Gen (SpCas9) und die sgRNAs in vivo gemeinsam zu übertragen und sicherzustellen, dass die SpCas9-Nuklease degradiert und das Zielgen gestört wird.
Die zweite Neuerung ist die Entwicklung einer High-Fidelity-Variante von SpCas9, die modifiziert wurde, um unspezifische DNA-Kontakte zu reduzieren [22].
3. Abschließende Bemerkungen
Die oben beschriebenen Innovationen sind nur einige der jüngsten Versuche, die CRISPR / Cas9-Technologie in Richtung klinischer Translation voranzutreiben. Ziel ist es, das Risiko von unbeabsichtigten Indels, anhaltender oder eingeschränkter Expression von Cas9, dosisabhängiger Toxizität, Zytotoxizität, Immunogenität, exosomalem Einschluss und vorzeitigem Abbau der CRISPR / Cas9-Maschinerie zu verringern oder zu beseitigen und sicherzustellen, dass das transportierte Produkt stabil, effektiv und für die Zielgruppe (n) zugänglich bleibt.
REFERENZEN