Mit dem neuen HotScriptase RT 2X Cell Mastermix > von Genaxxon lassen sich RNA-Vireninfektionen ohne vorherige Isolation oder Reinigung von RNA direkt aus verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Speichel oder aus Spermaflüssigkeit mittels RT-PCR/RT-qPCR direkt nachweisen.
Der normalerweise schwierige Nachweis von Viren-RNA erfolgt mit dem neuen Enzym HotScriptase RT > bzw. dem HotScriptase RT 2X Cell Mastermix einfach und schnell und ohne die ansonsten vorherige zeitraubende isothermale Transkription.
Zur den humanpathogenen Flaviviren gehören unter anderem das Gelbfieber-Virus, das Denguevirus (Denguefieber), das FSME-Virus (Frühsommer-Meningoencephalitis) oder
das Zika-Virus (ZIKV).
Zur Gattung Hepacivirus gehören das Hepatitisvirus C (Typusart) und Hepatitisvirus G.
Zur Gattung der Pestiviren gehören Erreger von Tierseuchen wie das Hog-cholera-Virus
(europäische oder klassische Schweinepest), das bovine diarrhea virus (Typusart; bovine
Virusdiarrhoe) und das Border-disease-Virus der Schafe.
Mehr weiterführende Informationen zum Thema Flaviviridae oder Zika-Virusinfektion finden Sie bei Wikipedia: Flaviviridae > - Zika-Virus >.
Auszug aus dem HotScriptase RT Cell Mastermix Protokoll >
- Prepare the PCR reaction mixture according to Table 1.
The master mix typically contains all of the components needed for RT-PCR except primers and template. - Program the thermal cycler according to the manufacturer’s instructions.
A typical RT-PCR cycling program is outlined in Table 2. For maximum yield and specificity, temperatures and cycling times should be optimized for each new target or primer pair. - Place PCR tubes in the thermal cycler and start program
Table 1: Recommendations for PCR / Reaction Setup (50µL PCR reaction)
| Components | Volume | Final concentration |
| Primer forward (10µM) Primer reverse (10µM) HotScriptase RT Cell Mastermix Template/Sample extract* Nuclease-free water | 1µL 1µL
2µL - 10.5µL up to 25µL total reaction volume | 0.5µM (0.05-1µM) 0.5µM (0.05-1µM)
10 to <10000 cells
|
*Recommended final template concentration is between 5ng/µL to 500ng/µL.
Table 2: Typical “Zero-Step” RT-PCR protocol (an isothermal reverse transcription step is not needed)
| Step | Temperature | Time |
| Initial denaturation Denaturation Annealing/Extension* Hold | 95°C 95°C >57°C – 75°C <10°C | 2 min. 15 sec. min. 60 sec. (25 – 40 cycles) hold |
NOTE: HotScriptase RT does not have an activity optimum at 68°C! For this reason you can use much higher temperatures for elongation if needed (if the primer sequence does allow higher temperatures)
NOTE: A “Two-Step” as well as “Three-Step” PCR protocol can be used.
If primer needs annealing temperatures below 68°C a three step protocol is recommended.
NOTE: A new RT-PCR is ideally established by running a temperature gradient in order to find the best annealing/extension temperature for each new primer pair.
NOTE: Optimal PCR protocol times and temperatures may vary depending on the used cycler, the nature of template and the amplicon length.
