Nachweis von RNA-Viren-Infektionen, z.B. von Flaviviridae (Flavivirus, Pestivirus und Hepacivirus).

Mit dem neuen HotScriptase RT 2X Cell Mastermix > von Genaxxon lassen sich RNA-Vireninfektionen ohne vorherige Isolation oder Reinigung von RNA direkt aus verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Speichel oder aus Spermaflüssigkeit mittels RT-PCR/RT-qPCR direkt nachweisen.

Der normalerweise schwierige Nachweis von Viren-RNA erfolgt mit dem neuen Enzym HotScriptase RT > bzw. dem HotScriptase RT 2X Cell Mastermix einfach und schnell und ohne die ansonsten vorherige zeitraubende isothermale Transkription.

Zur den humanpathogenen Flaviviren gehören unter anderem das Gelbfieber-Virus, das  Denguevirus (Denguefieber), das FSME-Virus (Frühsommer-Meningoencephalitis) oder
das Zika-Virus (ZIKV).
Zur Gattung Hepacivirus gehören das Hepatitisvirus C (Typusart) und Hepatitisvirus G.
Zur Gattung der Pestiviren gehören Erreger von Tierseuchen wie das Hog-cholera-Virus
(europäische oder klassische Schweinepest), das bovine diarrhea virus (Typusart; bovine
Virusdiarrhoe) und das Border-disease-Virus der Schafe.

Mehr weiterführende Informationen zum Thema Flaviviridae oder Zika-Virusinfektion finden Sie bei Wikipedia: Flaviviridae > - Zika-Virus >.

Auszug aus dem HotScriptase RT Cell Mastermix Protokoll >

  1. Prepare the PCR reaction mixture according to Table 1.
    The master mix typically contains all of the components needed for RT-PCR except primers and template.
  2. Program the thermal cycler according to the manufacturer’s instructions.
    A typical RT-PCR cycling program is outlined in Table 2. For maximum yield and specificity, temperatures and cycling times should be optimized for each new target or primer pair.
  3. Place PCR tubes in the thermal cycler and start program

Table 1: Recommendations for PCR / Reaction Setup (50µL PCR reaction)

Components

Volume

Final concentration

Primer forward (10µM)

Primer reverse (10µM)

HotScriptase RT Cell Mastermix

Template/Sample extract*

Nuclease-free water

1µL

1µL


12.5µL

2µL - 10.5µL

up to 25µL total reaction volume

0.5µM (0.05-1µM)

0.5µM (0.05-1µM)


1X

10 to <10000 cells

 

 *Recommended final template concentration is between 5ng/µL to 500ng/µL.


Table 2:
Typical “Zero-Step” RT-PCR protocol (an isothermal reverse transcription step is not needed)

Step

Temperature

Time

Initial denaturation

Denaturation

Annealing/Extension*

Hold

95°C

95°C

>57°C – 75°C

<10°C

2 min.

15 sec.

min. 60 sec. (25 – 40 cycles)

hold

 NOTE:      HotScriptase RT does not have an activity optimum at 68°C! For this reason you can use much higher temperatures for elongation if needed (if the primer sequence does allow higher temperatures)

NOTE:      A “Two-Step” as well as “Three-Step” PCR protocol can be used.
If primer needs  annealing temperatures below 68°C a three step protocol is recommended.

NOTE:      A new RT-PCR is ideally established by running a temperature gradient in order to find the best annealing/extension temperature for each new primer pair.

NOTE:      Optimal PCR protocol times and temperatures may vary depending on the used cycler, the nature of template and the amplicon length.

RT-PCR HotScriptase

Bitte geben Sie die Zeichenfolge in das nachfolgende Textfeld ein

Die mit einem * markierten Felder sind Pflichtfelder.