Probleme mit Sekundärstrukturen der RNA

RNA liegt im Gegensatz zur DNA normalerweise als Einzelstrangmolekül vor, doch kann es durch Rückfaltung des Einzelstrangs zur Ausbildung von Sekundärstrukturen kommen.
Als Sekundärstruktur von Nukleinsäuren (DNA und RNA) bezeichnet man eine 2D-Faltung des Einzelstrangs. Da es bei RNA keinen komplementären Gegenstrang gibt, erfolgt die Basenpaarung durch Rückfaltung des Einzelstrangs, so dass sich komplementäre Abschnitte paaren können. Die Sekundärstruktur wird, ähnlich wie bei der doppelsträngigen DNA, über Wasserstoffbrücken der komplementären Basen gebildet und ist umso stabiler, je mehr GC-Basen gepaart sind. Zu den Sekundärstrukturen der RNA zählen zum Beispiel Hairpin-, Stemloop- und Loop-Strukturen (https://de.wikipedia.org/wiki/Ribonukleinsäure).

Sekundär- und Tertiärstrukturen müssen für einen optimalen Ablauf der reversen Transkription aufgelöst werden. Dies erfordert je nach Länge der komplementären Struktur und je nach Basenpaarung (hoher GC-Gehalt) erhöhte Temperaturen.
Im Gegensatz zur HotScriptase RT von Genaxxon sind konventionelle zur RT-PCR verwendete reverse Transkriptasen - wie die M-MuLV (M3042) und die AMV Reverse-Transkriptase - nicht thermostabil und arbeiten deshalb nur bei Temperaturen zwischen 37°C und 42°C. Bei diesen niedrigen Arbeitstemperaturen der konventionellen reversen Transkriptasen werden möglicherweise stabile Sekundärstrukturen in der RNA nicht aufgebrochen. Dadurch können z.B. Bindungsstellen der Primer an der RNA unzugänglich sein (Verhinderung der ganzen reversen Transkription), oder eine begonnene reverse Transkription endet an einer Loopstruktur und kann deshalb nicht vollendet werden (unvollständige reverse Transkription).

Mit der HotScriptase RT Polymerase von Genaxxon gehören solche Probleme nun der Vergangenheit an. Die reverse Transkription und DNA-Amplifikation erfolgen parallel während einer Standard-PCR. Da die PCR bei höheren Temperaturen durchgeführt wird und gleichzeitig ein Denaturierungsschritt von 95°C eingebaut ist, stellen Sekundärstrukturen bzw. hohe GC-Gehalte kein Problem mehr dar. Sämtliche Schritte können bei Temperaturen über 55-75°C durchgeführt werden. Dies führt dazu, dass mit der HotScriptase RT auch RNA in cDNA umgeschrieben und amplifiziert werden kann, wo andere reverse Transkriptasen versagen.
Noch einfacher geht es mit unserem HotScriptase RT Mastermix. Sie müssen nur noch Primer und mRNA zum Mastermix pipettieren und das PCR-Programm starten.

Auszug aus dem > Protokoll für die HotScriptase RT Polymerase:

1. Thaw 5X buffer, dNTPs or dNTP-mix and primer solutions at RT or on ice.
2. Prepare a master mix according to Table 1.
   The master mix typically contains all of the components needed for RT-PCR except primers and template.
3. Program the thermal cycler according to the manufacturer’s instructions.
   A typical RT-PCR cycling program is outlined in Table 2. For maximum yield and specificity, temperatures and cycling times should be optimized for each new target or primer pair.
4. Place PCR tubes in the thermal cycler and start program

Table 1: Recommendations for PCR / Reaction Setup (50µL PCR reaction)

                   *Recommended final template concentration is between 5ng/µL to 500ng/µL.

Table 2: Typical “Zero-Step” RT-PCR protocol (an isothermal reverse transcription step is not needed)

 NOTE:      HotScriptase RT does not have an activity optimum at 68°C as Taq-Polymerase. For this reason you can use much higher temperatures for elongation if needed (if the primer sequence does need higher temperatures)

NOTE:      A “Two-Step” as well as “Three-Step” PCR protocol can be used. If primer needs low annealing temperatures a three step protocol is recommended.

NOTE:      A new RT-PCR is ideally established by running a temperature gradient in order to find the best annealing/extension temperature for each new primer pair.

NOTE:      Optimal PCR protocol times and temperatures may vary depending on the used cycler, the nature of template and the amplicon length.