Isolieren Sie miRNA, RNA und DNA
mit nur einem Kit von Genaxxon!

Genaxxon schlägt drei Fliegen mit einer Klappe, indem es ein miRNA Reinigungskit anbietet, mit dem neben kleinen RNA Fragmenten (miRNA, siRNA) auch DNA und große RNA Fragmente isoliert werden können.

Sind Sie interessiert wie das alles mit nur einem Kit funktioniert?
Dann lesen Sie weiter.

Spätestens seit der Corona Pandemie ist RNA in aller Munde, denn bei dem SARS-CoV-2 Virus handelt es sich um ein Betacoronavirus, dessen Virusgenom aus einzelsträngiger RNA besteht.
Doch neben diagnostischen Anwendungen, wie dem Nachweis von RNA Viren, kommt RNA in der Forschung noch in einer Vielzahl von Methoden zum Einsatz.

Durch die Isolierung von RNA kann die momentane Zelltätigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle untersucht werden. Dies wird dadurch möglich, da nur die Gene, die aktuell in der Zelle transkribiert werden, im Moment der Isolierung als RNA vorliegen. Die isolierte RNA kann also mit verschiedenen Methoden zur Untersuchung der Genexpression genutzt werden.

Doch neben den direkt an der Genexpression beteiligten RNA Molekülen (mRNA, tRNA und rRNA), gibt es noch andere Varianten des RNA Moleküls, wie etwa die Micro RNA (miRNA).
Diese kleinen RNAs sind an dem Prozess der RNA Interferenz beteiligt. Sie sorgen dafür, dass die messenger-RNAs (mRNA) entweder nicht oder nur in geringem Umfang in ein Protein umgesetzt werden (Gene Silencing), oder gleich komplett abgebaut werden. Da die RNA Interferenz normalerweise erst nach der Transkription einsetzt, wird sie auch als posttranskriptionelles Gene-Silencing (PTGS) bezeichnet. Dadurch sind miRNAs in der Lage Gene zu regulieren oder sogar gezielt auszuschalten.

MikroRNA Moleküle wurden erstmals 1993 beschrieben. Einen Durchbruch in der Wissenschaft stellt in diesem Zusammenhang die Entdeckung der RNA Interferenz dar. Der Prozess der posttranskriptionellen Gen-Stilllegung (gene silencing) wurde 1998 beschrieben, wofür Andrew Fire und Craig Mello 2006 den Nobelpreis erhielten.
Sie waren sich der Tragweite ihrer Entdeckung bewusst und sagten unter anderem in ihrer Dankesrede zum Nobelpreis: „Die RNA-Interferenz ist eine vergleichsweise einfache und universelle Methode, um einzelne Gene abzuschalten, indem ihre Boten-RNA über einen komplexen Mechanismus mit Hilfe von doppelsträngigen, kleinen RNA-Molekülen gezielt abgebaut wird. Sie (…) hat bereits jetzt einen unschätzbaren Beitrag zum Verständnis molekularer und medizinisch relevanter Zusammenhänge geschaffen“ (zitiert nach Ärztezeitung, 13.03.2006).

Doch die Forschung machte hier nicht Halt. Bereits im Jahre 2001 gelang es Thomas Tuschl mit synthetischen RNA-Stücken, sogenannter siRNA, gezielt Gene in Humanzellen auszuschalten.
Bei dieser Technik wird eine passend zu einer mRNA konstruierte siRNA durch Transfektion in Zellen eingeschleust. In den Zellen verlangsamt die siRNA gezielt die Bildung eines bestimmten Proteins oder verhindert die Bildung des Proteins sogar ganz.
Diese Methode kann dabei helfen, die Funktion bestimmter Gene kennen zu lernen. Indem die Translation bestimmter Gene reduziert oder ganz abgeschaltet wird, kann anschließend in den betroffenen Zellen beobachtet werden, welche Abläufe davon beeinträchtigt werden.

Es gibt bereits Einsatzgebiete für diese neue Technik. In der Pflanzenforschung wird zB. gezielt Einfluss auf die Reifung von Früchten oder auf die Produktion bestimmter Inhaltsstoffe der Pflanzen genommen. Ebenfalls laufen Versuche mit sogenannten RNA Sprays, wo versucht wird Pflanzen vor Krankheitserregern oder Fressfeinden zu schützen. Diese Sprays enthalten kleine RNA Moleküle, die von Krankheitserregern oder Fressfeinden aufgenommen werden. Durch RNA Interferenz können dann lebenswichtige Gene der Krankheitserreger oder Fressfeinde gezielt abgeschaltet werden. Möglicherweise in der Zukunft eine Alternative zum Einsatz von Pestiziden?

Auch bei der Bekämpfung von Krankheiten kann man die RNA-Interferenz möglicherweise einsetzen, so etwa bei der Behandlung viraler Infektionen oder Krebs. Da die RNA-Interferenz erst Ende der 90er Jahre entdeckt wurde, steckt die Forschung zu diesem Thema noch am Anfang.

Doch kommen wir jetzt, nach dem Ausflug in die aktuelle Forschung, wieder zurück zur RNA Reinigung.

Allgemein ist bei Arbeiten mit RNA zu berücksichtigen, dass die Stabilität der RNA geringer ist als die der DNA. Im Vergleich zur Desoxyribose der DNA hat die Ribose der RNA ein Sauerstoffatom mehr. Das macht die RNA gegenüber der DNA sehr instabil. Dafür ist die RNA aber chemisch aktiver und kann sich zu vielen verschiedenen Formen falten.
Zudem ist die RNA stets einem Angriff zelleigener und ubiquitär vorkommender RNasen ausgesetzt, die die RNA abbauen.
Da RNasen eine hohe Thermostabilität besitzen, hier schon vorab der Hinweis, bei der Reinigung von RNA besondere Sorgfalt walten zu lassen.
Man sollte bei der Reinigung frühzeitig RNA und RNasen trennen und zudem sicherstellen, dass keine RNasen aus der Umgebung in die Proben gelangen. Darum ist das Tragen von Einmalhandschuhen (M6140, M6143) während der Reinigung sehr wichtig. Ebenso kann es von Vorteil sein, einen bestimmten Satz an Verbrauchsmaterialien nur für RNA Arbeiten zu benutzen. Zudem sollte spezielles RNase freies DEPC Wasser (M6082)  verwendet werden.

Im Allgemeinen lassen sich die einzelnen Schritte einer RNA Reinigung wie folgt beschreiben:

• Bei der Isolierung von RNA werden zunächst Zellen durch Zentrifugation gewonnen, oder Gewebe homogenisiert, um interzelluläre Bindungen (Epithelgewebe) abzubauen und hochmolekulare Proteine (Muskel oder Bindegewebe) zu fragmentieren.
• Für die Homogenisierung empfiehlt sich die Verwendung von Ceramic Beads (S5310), die für eine Vielzahl von Geweben, Zellen aus Zellkulturen, Pflanzengewebe oder sogar ganzen Insekten geeignet sind.
• Dann wird das Homogenat mit Guanidinthiocyanat und Detergentien lysiert. Jegliche RNasen werden mit Guanidinthiocyanat und β-Mercaptoethanol inaktiviert.
• Ein nachfolgender dreistufiger Waschschritt entfernt effektiv Verunreinigungen und Enzyminhibitoren.
• Mit Hilfe eines Puffers mit geringer Ionenstärke (zB. TE Puffer (M3098)), mit RNase-freiem Wasser (M6340) oder DEPC Wasser (M6082) wird die gereinigte RNA eluiert.

Doch was ist jetzt das Spezielle an dem "miRNA Purification Mini Spin Kit" (S5305) von Genaxxon?

Das "miRNA Purification Mini Spin Kit" (S5305) wurde speziell für die Isolierung und Reinigung von miRNA und DNA aus Gewebe und Zellen entwickelt.
Das Kit bietet eine schnelle, effiziente und phenolfreie Extraktion von hoch angereicherten kleinen RNA-Fragmenten (<200nt) mit überragender Ausbeute und Reinheit aus einer Vielzahl von Zellen, Gewebe und Blut.

Zusätzlich ist es möglich, parallel zu kurzen auch längere RNA-Fragmente (>200nt) oder DNA aus demselben Ansatz zu isolieren, da der Kit mit drei unterschiedlichen Reinigungssäulchen geliefert wird:

1. Für die Entfernung (Isolation) von DNA;
2. Für die Reinigung von langen RNA-Fragmenten (28S rRNA, 18S rRNA) und
3. Für die Reinigung von kleinen RNA-Molekülen (tRNA, 5S rRNA, 5.8S rRNA sowie regulatorische RNA-Moleküle wie microRNA (miRNA) und short interfering RNA (siRNA)).
   
   

Ein Blick in das Protokoll des Genaxxon "miRNA Purification Mini Spin Kit" (S5305) zeigt, dass die Reinigung fortlaufenden Arbeitsschritten folgt, die an drei Punkten nacheinander die Isolierung von DNA, langen RNA Fragmenten und schließlich kurzen RNA Fragmenten vorsieht.

Dies ist ein weiterer Vorteil des Genaxxon "miRNA Purification Mini Spin Kit" (S5305), da für die Reinigung von DNA, RNA und miRNA keine unterschiedlichen Protokolle abgearbeitet werden müssen. Sowohl die gereinigten kleinen und großen RNA Moleküle, als auch die DNA können nach der Isolation mit dem Genaxxon "miRNA Purification Mini Spin Kit" (S5305) direkt in nachgeschalteten Anwendungen, wie beispielsweise RT-PCR, RT-qPCR, Northern-Blotting, PCR, qPCR usw., verwendet werden.

Aufgrund der Empfindlichkeit der RNA Proben empfiehlt sich eine Lagerung in Kryo-Röhrchen (I2102) bei -80°C.

Je nach Ihren Fragestellungen und Anforderungen bietet Ihnen Genaxxon noch weitere RNA Reinigungskits an:

• Total RNA Purification Mini Spin Kit (S5304) zur Isolation von Gesamt RNA
• Total RNA Purification Mini Spin Kit PLUS (S5309) wie S5304, nur mit Ceramic Beads
• RNA Purification from Bacteria and Yeast Kit (S5320) zur Isolation von RNA aus Bakterien- oder Hefekulturen
• Viral RNA Purification Kit (S5301) zur Isolation von RNA und DNA aus einer Vielzahl von Krankheitserregern wie Viren oder Bakterien
  
  

Sollten Ihnen einmal die Spin columns aus den Reinigungskits ausgehen - nicht verzagen,
Genaxxon bietet Ihnen eine nachhaltige Lösung an:
RNA Mini Spin Reinigungssäulchen (S5311) separate RNA spin columns, mit denen Sie Ihre
noch vorhandenen Puffer sinnvoll und nachhaltig aufarbeiten können!