Die Gensuperfamilie der Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) und CRISPR-assoziierten (Cas) Nucleasen entwickelte sich in Archaea und Bakterien als Mechanismus der erworbenen Wirtsabwehr gegen wiederholte Virustransduktion und / oder Plasmidtransfektion. Bisher wurden verschiedene CRISPR / Cas-Systeme isoliert und nach ihrer Molekülstruktur, Substratspezifität und den Bedingungen, die ihre optimale Aktivität unterstützen, klassifiziert [1-3].
CRISPR / Cas9, ein gut untersuchtes Mitglied dieser Superfamilie, wurde in eukaryotischen Versuchsmodellen als Werkzeug zur Geneditierung umfunktioniert [4-6]. Es besteht aus einer Single-Guide-RNA (sgRNA), die ihr DNA-Ziel anhand der Watson-Crick-Basenpaarung erkennt und die Cas9-Endonuklease zu einem vorbestimmten Zielort neben einem Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) leitet, wo Cas9 ortsspezifisch Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA generiert [7]. In Eukaryoten können Cas9-induzierte DSBs auf zwei Arten repariert werden:
(i) Nicht homologe Endverbindung (NHEJ): Ein effizienter, aber fehleranfälliger Mechanismus, der Insertions- / Deletions- (Indel-) Mutationen an der Reparaturstelle und / oder an anderer Stelle im Genom einführen kann. NHEJ eignet sich für Geninaktivierungs- oder Deletionsmutationen, die nicht auf die Erhaltung der die betroffene Stelle flankierenden Sequenzen angewiesen sind.
(ii) Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR): Die Methode der Wahl in mitotisch aktiven Zellen, wenn eine präzise genetische Veränderung erforderlich ist, und ein Donor-Template mit Homologie zu den Sequenzen, die das DSB flankieren, werden bereitgestellt [Dai 2016]. In postmitotischen CRISPR / Cas9-exprimierenden Zellen kann eine HDR erreicht werden, wenn die DNA-Matrize von einem Vektor des Adeno-assoziierten Virus (AAV) geliefert wird [8].
Die Einfachheit, Vielseitigkeit, das kostengünstige Design und die Benutzerfreundlichkeit von CRISPR / Cas9 machen es zu einer beliebten Wahl für die Modellierung der Entwicklung und Krankheit von Tieren und Pflanzen. Es gibt jedoch viele mögliche Komplikationen, von denen einige nachstehend aufgeführt sind, die seine weit verbreitete Anwendung in vivo behindern. Unter den vielen möglichen Faktoren sind Cas9-assoziierte Off-Target-DSBs. Hier beschreiben wir einige der Methoden und Ressourcen, die verfügbar sind, um sie vorherzusagen und zu erkennen.
Komplikationen der CRISPR / Cas9-Gentechnologie bei Eukaryoten [7, 9-15]
• Die Abgabe des CRISPR / Cas9-Systems durch einen integrierenden oder nicht integrierenden viralen Vektor führt zu einer verlängerten Expression des CRISPR / Cas9-Systems in Zielzellen / -geweben.
• Die CRISPR / Cas9-Expression ist nicht zell- / gewebespezifisch.
• Die ektopische Expression von CRISPR / Cas9 birgt das Risiko einer malignen Transformation, des Zelltods oder eines anderen veränderten Zell- / Gewebephänotyps.
• Die Freisetzung von CRISPR-Cas9 durch Integration viraler Vektoren ist hocheffizient, die Integration erfolgt jedoch an zufälligen Stellen im Wirtsgenom.
• Die Abgabe von Cas9-mRNA in vivo ist aufgrund ihrer Größe ineffizient.
• mRNA / sgRNA- oder RNP-Komplexe sind nach der Abgabe instabil.
• CRISPR / Cas9 weist eine Unspezifität des DNA-Ziels auf, was zu einer Spaltung / Bindung / Bearbeitung außerhalb des Ziels führt.
• Einfügungen / Löschungen (Indels) werden durch fehlerhafte NHEJ von DSBs verursacht.
• Mosaikismus in Mausembryonen, der auf das Versagen von Nukleasen zurückzuführen ist, DSBs im 1-Zell-Stadium einzuführen.
• Die asynchrone Zellteilung verringert die Effizienz der DSB-Reparatur durch HDR.
• Multiple Allele - Die Reparatur von DSBs durch NHEJ erzeugt (i) Kohorten von Mäusen mit unterschiedlichen Mutationen aus denselben Targeting-Konstrukten, die eine Genomsequenzierung erfordern, um die Art und Position der spezifischen Mutation zu überprüfen. und / oder (ii) Mäuse mit Mosaiken multipler Mutationen, die gezüchtet werden müssen, um Mäuse, die einzelne Mutationen tragen, zu trennen und zu isolieren.
• CRISPR / Cas9 (± Vektor) ist in vivo immunogen.
Selbst wenn die strengsten Maßnahmen ergriffen wurden, um eine Aktivität außerhalb des Ziels zu vermeiden, ist es ratsam, das gesamte Genom auf unbeabsichtigte Änderungen zu untersuchen, jedoch erst, nachdem die Mutation im Ziel bestätigt wurde [16]. Der Grund dafür ist, dass die monomere Cas9-Nuklease eher zu Nebenwirkungen neigt als die dimeren Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und transkriptionsaktivatorähnlichen Effektor-Nukleasen (TALENs). Dies wird auf die geringere Größe, die Fähigkeit, kürzere Zielsequenzen zu erkennen, und die Fähigkeit der gRNA zurückgeführt, eine bestimmte Anzahl von Fehlpaarungen zu tolerieren [16]. Zu den verschiedenen Ressourcen, die entwickelt wurden, um nicht zielgerichtete Änderungen zu identifizieren, gehören:
1. Off-target Vorhersagemodellierung.
2. Protokolle, die Off-Target-DSBs an vorhergesagten Orten erkennen (verzerrte Erkennung).
3. Protokolle, die Off-Target-DSBs im gesamten Genom erkennen (unverzerrte Erkennung)
1. Off-target Vorhersagemodellierung: Diese Programme basieren auf Sequenzähnlichkeit, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf die verwendeten Suchalgorithmen und die verwendeten Suchparameter (d.h. max. Anzahl der Nichtübereinstimmungen, zulässige PAMs, Vollständigkeit der Suche) [17 ]. Ohne Validierung haben sie eine begrenzte Vorhersagekraft und können hohe falsch-positive Raten liefern [18].
1.1 Cas-OFFinder [19]
1.2 CRISPOR [20-21]
1.3 CHOP-CHOP v3 [22-23]
1.4 CRISPR-DO (CRISPR Design and Optimization) [6, 24]
1.5 CRISPR ML [17, 25]
1.6 CRISPR-offinder [26]
1.7 CROP-IT (CRISPR Off-target/cleavage Prediction and Identification Tool) [17]
1.8 COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions, and Deletions) [27]
2. Protokolle zum Nachweis von Off-Target-DSBs an prognostizierten Stellen (Bias-Detection): Methoden zum Nachweis von On-Target-Mutationen können auch zur Analyse von Off-Target-Änderungen verwendet werden, sofern die Stellen bekannt sind [16]. Die folgenden Protokolle sind Beispiele:
2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt große Indels, sehr große Chromosomen-Deletionen (> 1 x 10e6 bp).
• Kann bestimmen, ob eingefügt oder entfernt werden soll.
• Mäßiger Durchsatz.
• Übersieht kleine Indels.
2.2 CAPS-Analyse (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt alle Mutationen.
• Sehr empfindlich, praktisch.
• Mäßiger Durchsatz.
• Die Art der Mutation kann nicht bestimmt werden.
• Die Detektion ist abhängig von der Anwesenheit einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an oder <5 bp von der Nuklease-Schnittstelle entfernt (d. H. Die Verfügbarkeit von Restriktionsstellen, die die Fehlpaarung abdecken, kann ein begrenzender Faktor sein).
2.3 Fluoreszenz-PCR-Kapillargelelektrophorese [16]
Eigenschaften
• Erkennt vorzugsweise kleine Indels.
• Einzelne Nukleotidauflösung, kann daher Frameshift-Mutationen erkennen.
• Hoher Durchsatz.
• Empfindlichkeit: 1,0%.
• Zeigt nicht an, welche Nukleotide eingefügt / entfernt wurden.
• SNPs und große Indels können nicht erkannt werden.
• Überschätzt Mutationen> 30 bp.
2.4 Heteroduplex-Mobilitätsassay durch PAGE [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt kleine Indels.
• Empfindlichkeit: 0,5%.
• Die Art der Mutation kann nicht bestimmt werden.
• Mäßiger Durchsatz.
• Übersieht große Indels.
2.5 HRMA (hochauflösende Schmelzanalyse) [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt kleine Indels.
• Empfindlichkeit: 2,0%.
• Legt fest, ob eine Mutation eingefügt oder entfernt wird.
• Hoher Durchsatz.
• Übersieht große Indels.
2.6 Verlust einer Primerbindungsstelle [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt Indels.
• Empfindlichkeit: 10,0%.
• Kann die Art der Mutation bestimmen.
• Hoher Durchsatz.
• Fehlende Auswechslungen.
2.7 Fehlpaarungs-Spaltungstest [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt kleine Indels.
• Empfindlichkeit: 0,5% - 3,0%.
• Die Art der Mutation kann nicht bestimmt werden.
• Mäßiger Durchsatz.
• T7-Endonuklease 1 (T7E1) kann einzelne Nukleotidänderungen übersehen.
2.8 NGS (Next Generation Sequencing) [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt alle Mutationen.
• Kann bestimmen, ob eingefügt oder entfernt werden soll.
• Hoher Durchsatz.
• Empfindlichkeit: 0,01%.
• Übersieht große Indels.
• Teuer.
2.9 Sanger-Sequenzierung [16]
Eigenschaften
• Erkennt bevorzugt alle Mutationen.
• Kann die Art der Mutation bestimmen.
• Einfach, schnell und überall verfügbar.
• Empfindlichkeit: 1,0 - 2,0%.
• Geringer Durchsatz.
• Kostspielig.
• Arbeitsintensiv.
3. Protokolle, die genomweite (unvoreingenommene) Off-Target-DSBs erkennen:
3.1 BLESS (Direkte In-situ-Unterbrechungsmarkierung, Anreicherung an Streptavidin und Sequenzierung der nächsten Generation) [16, 28]
Eigenschaften
• Direkte In-situ-Kennzeichnung von DSBs.
• Semiquantitativ, da keine geeigneten Kontrollen für die PCR-Amplifikationsverzerrungen vorhanden sind, die Anwendungen einschränken und die Skalierbarkeit beeinträchtigen.
• Erkennt nur DSBs, die zum Zeitpunkt der Kennzeichnung vorhanden sind.
• Referenzgenom erforderlich.
3.2 BLISS (Breaks Labeling in situ und Sequenzierung) [28]
Eigenschaften
• Nachweis endogener und exogener DSBs in Proben mit geringem Input von Krebszellen, embryonalen Stammzellen und Lebergewebe.
• Voreingenommene Profilerstellung von On- und Off-Target-DSBs, die durch Cas9- und Cfp1-Nukleasen eingeführt wurden.
• Direkte Markierung von DSBs in fixierten Zellen oder Gewebeschnitten auf einer festen Oberfläche.
• Geringer Inputbedarf durch lineare Amplifikation markierter DSBs durch In-vitro-Transkription.
• Quantifizierung von DSBs durch eindeutige molekulare Identifikatoren.
• Einfache Skalierbarkeit und Multiplexing.
• Vielseitig, empfindlich, quantitativ.
3.3 Sequenzierung der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-Seq) [14, 28]
Eigenschaften
• Genomweite (unverzerrte) Erkennung.
• Markiert DSBs nicht direkt.
• DNA-Breakpoints mit Einzel-Nukleotid-Auflösung können nicht identifiziert werden.
• Die meisten von "totem" Cas9 (dCas9) erkannten Off-Target-DNA-Bindungsstellen werden von Cas9 in Zellen überhaupt nicht gespalten.
3.4 CIRCLE-Seq (Zirkularisierung zur In-vitro-Erfassung von Spaltungseffekten durch Sequenzierung)
(https://github.com/tsailabSJ/circleseq >) [18, 29]
Eigenschaften
• Verwendet Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation; benötigt keine Referenzgenomsequenz.
• Beseitigt den hohen Hintergrund von zufälligen Lesevorgängen, die mit Digenome-seq beobachtet wurden.
• Entfernt die DNA aller gebundenen Proteine vor dem Nukleaseverdau, was zu einer effizienten Spaltung aller potenziellen Stellen durch die Cas9-Nuklease führt.
• Identifiziert echte Off-Target-Mutationen, die mit zelltypspezifischen SNPs assoziiert sind.
• Für die meisten getesteten Cas9-gRNA-Komplexe kann CIRCLE-Seq alle Off-Target-Stellen in der humanen genomischen DNA identifizieren, die durch GUIDE-Seq und Hochdurchsatz-Gentranslokationssequenzierung (HTGTS) gefunden wurden.
• Mögliches Profiling von Off-Target-Mutationen in Organismen ohne vollständige Genomsequenz oder in Outbred-Populationen mit erheblicher Sequenzheterogenität, da keine Referenzgenomsequenz erforderlich ist.
• Einführung von DSBs in vitro, die zu erheblichen Unter- / Überschätzungen der Anzahl der Zielstellen führen können, die in Zellmodellen oder in vivo tatsächlich modifiziert werden.
• Es ist schwierig, Reparaturergebnisse anhand von In-vitro-Daten vorherzusagen.
Hinweis - Die Nukleasekonzentration in der Zelle, die Abgabemethode (RNP vs. Plasmid vs. integrierendes Virus vs. nicht integrierendes Virus) und die Zugänglichkeit von Chromatin beeinflussen alle die Bearbeitungsergebnisse erheblich und werden im Allgemeinen von In-vitro-Off-Target-Tests übersehen [18].
3.5 Digenome-Seq (www.rgenome.net/digenome/) [12, 14, 28-29]
Eigenschaften
• Empfindlichkeit: <0,1%.
• Kosteneffizient.
• Verlässt sich auf die Nuklease-Spaltung von genomischer DNA, die Sequenzierung der Adapter-Ligation an alle freien Enden (Nuklease- und Nicht-Nuklease-induziert), die Hochdurchsatz-Sequenzierung und die bioinformatische Identifizierung von Nuklease-gespaltenen Stellen mit einheitlichen Mapping-Endpositionen.
• Erfordert eine große Anzahl von Lesevorgängen (̴̴ 4 x 10e8).
• Aufgrund des hohen Hintergrunds zufälliger DNA-Lesevorgänge ist es schwierig, durch Nukleasen induzierte Spaltungsereignisse mit niedriger Frequenz zu identifizieren.
• Führt DSBs in vitro ein, aber dieser Ansatz ist möglicherweise nicht repräsentativ für relevante Nukleasekonzentrationen und für zelluläre Eigenschaften, z. Chromatin-Umgebung, Kernarchitektur, die die Häufigkeit von DNA-Brüchen und -Reparaturen beeinflussen könnte.
3.6 DISCOVER-Seq (Entdeckung von In-Situ-Cas-Off-Targets und Überprüfung durch SEQuencing) [16, 18, 30]
Eigenschaften
• Ermöglicht den direkten Nachweis in vivo in Echtzeit (z. B. Zelllinien, von Patienten stammende iPS-Zellen und lebende Tiermodelle während der Bearbeitung von adenoviralen Genen).
• Identifiziert die genauen Stellen im Genom, an denen ein DSB aufgetreten ist.
• Liefert direkt Daten zu echten Cas9-Spaltungsereignissen.
• Erkennt den Reparaturfaktor MRE11, einer der ersten Helfer an der Spaltstelle.
• Keine Notwendigkeit, DNA zu reinigen oder bestimmte zelluläre Modelle zu verwenden.
• Kann auf mehrere CRISPR / Cas-Systeme angewendet werden.
• Identifiziert zuverlässig echte In-vivo-Off-Targets, die von CIRCLE-Seq oder GUIDE-Seq verfehlt werden.
• Bestimmen Sie in einem 1-Schritt-Verfahren echte Off-Targets.
• In vivo Empfindlichkeit nicht so hoch wie in vitro CIRCLE-Seq.
• Erkennungsschwelle von Indels:> 0,8%.
3.7 DSBCapture [28, 31]
Eigenschaften
• Erfasst DSBs in situ.
• Kartiert DSBs direkt bei Einzelnukleotidauflösung, so dass der DSB-Ursprung bestimmt werden kann (d. H. Ob arzneimittelinduziert / strahleninduziert / usw.).
• Erfordert erhebliche Mengen an Eingangsmaterial (Millionen von Zellen).
• Arbeitsintensiv.
• Semiquantitativ, da keine geeigneten Kontrollen für die PCR-Amplifikationsverzerrungen vorhanden sind, die Anwendungen einschränken und die Skalierbarkeit beeinträchtigen.
3.8 Endsequenz [28, 32]
Eigenschaften
• Kann DSBs auf Einzelnukleotidebene in vivo auflösen.
• Semiquantitativ, da keine geeigneten Kontrollen für die PCR-Amplifikationsverzerrungen vorhanden sind, die Anwendungen einschränken und die Skalierbarkeit beeinträchtigen.
3.9 Exomsequenzierung [16, 18, 28]
Eigenschaften
• Voreingenommener Nachweis von Mutationen in kodierenden Regionen.
• Günstiger als die Sequenzierung des gesamten Genoms.
• Erkennt keine Mutationen in nicht kodierenden Regionen.
• Referenzgenom erforderlich.
3.10 GUIDE-Seq (Genomweite, nicht voreingenommene Identifikationen von durch Sequenzierung evaluierten DSBs) [13-14]
https://github.com/aryeelab/guideseq >
Eigenschaften
• Detektiert DSBs, die durch RNA-gesteuerte Nukleasen (RGNs) und möglicherweise andere Nukleasen eingeführt wurden.
• Identifizierung von RGN-unabhängigen Genom-Haltepunkten (Hotspots).
• Höhere Erkennungsempfindlichkeit als ChIP-Seq und vorhandene Vorhersagealgorithmen
• Es wurde festgestellt, dass verkürzte gRNAs deutlich reduzierte RGN-induzierte Off-Target-DSBs aufweisen
• Sicherheitsbewertung von CRISPR-Nukleasen vor der klinischen Anwendung
• Empfindlichkeit: 0,3%
• Testet das Schneiden von Nukleasen im zellulären Kontext, stützt sich jedoch auf die Integration von exogenen doppelsträngigen Oligonukleotiden (dsODNs), was in primären Zellen ineffizient ist und in vivo nicht anwendbar ist.
• dsODNs werden nur in 30-50% der DSBs integriert.
• Erkennt und quantifiziert DSBs, die von NHEJ repariert wurden, jedoch nicht auf anderen Reparaturwegen.
• Referenzgenom erforderlich.
• Falsch-Negative.
• Eingeschränkt durch die Zugänglichkeit von Chromatinen.
3.11 HTGTS (Genomweite Translokationssequenzierung mit hohem Durchsatz) [14, 16, 30]
Eigenschaften
• Erkennt große chromosomale Umlagerungen.
• Erkennt potenzielle Off-Target-Standorte und deckt Kollateralschäden auf, die durch wiederkehrende Translokationen verursacht werden.
• Erkennt und quantifiziert DSBs, die von NHEJ repariert wurden, jedoch nicht auf anderen Reparaturwegen.
• Verlässt sich auf das Zusammentreffen von DSBs, obwohl chromosomale Translokationen relativ selten sind.
• Referenzgenom erforderlich.
• Falsch-Negative.
• Eingeschränkt durch die Zugänglichkeit von Chromatinen.
3.12 IDLV (Integrase-Defective Lentiviral Vector) -vermittelte DNA-Brucherfassung [14, 28]
Eigenschaften
• Programmierbar.
• Empfindlichkeit: 1,0%.
• Erkennt und quantifiziert DSBs, die von NHEJ repariert wurden, jedoch nicht auf anderen Reparaturwegen.
• Testet das Schneiden von Nukleasen im zellulären Kontext, stützt sich jedoch auf die Integration eines exogenen DNA-Oligos, das in primären Zellen ineffizient und in vivo nicht anwendbar ist.
• Viele vertrauenswürdige Off-Target-Sites können nicht erfasst werden.
3.13 Sequenzierung des gesamten Genoms [16, 30]
Eigenschaften
• Wendet NGS der Bibliothek an, die aus dem gesamten Genom hergestellt wurde.
• Voreingenommene, umfassende Analyse.
• Erkennt SNPs, Indels und Strukturvarianten.
• Teuer.
• Erkennt nur höherfrequente Off-Target-Sites.
• Nicht sensitiv genug, um Off-Target-Sites in großen Populationen zu erkennen.
• Referenzgenom erforderlich.
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