T4 DNA-Ligase

T4 DNA Ligase katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 5' Phosphat and 3' Hydroxyenden in Doppelstrang DNA/RNA. 

Das Enzym kann sowohl glatte (blunt-end), als auch kohäsive DNA-Enden in duplex DNA/RNA verbinden. Es repariert Einzelstrangbrüche in Duplex DNA, RNA und DNA/RNA Hybriden.

Ligation von kohäsiven Enden:

Im Allgemeinen reicht eine 30 minütige Inkubation bei 20°C aus. Inkubationsbedingungen von 16°C für 4-16 Stunden werden aber ebenfalls regelmäßig eingesetzt. Die Ligation von glatten Enden oder von Einzelbasenüberhängen benötigt wesentlich mehr Enzym um dieselbe Effektivität wie die Ligation von kohäsiven Enden zu erreichen. Die Ligationseffizienz kann durch Zusatz von PEG oder durch Reduktion der rATP-Konzentration erhöht werden.

- T4-DNA-Ligase benötigt ATP > als Cofaktor. 
- T4-DNA-Ligase wird durch NaCL oder KCl ab einer Konzentration von 200 mM stark gehemmt.
- Um dieselbe Effizienz, wie bei der Ligation von kohäsiven Enden zu erreichen, erfordert die Ligation von blunt-end Fragmenten und Einzelbasenpaar-Überhängen etwas 50-mal mehr Enzym.
- Die Ligation von blunt-end Fragmenten kann durch Zugabe von PEG 4000 (10% w/v) Endkonzentration, Hexaminchlorid oder durch Reduzierung der ATP-Konzentration auf 50µM verbessert werden.
- Zur Verdünnung der T4-DNA-Ligase für die anschließende Lagerung bei -20 °C wird die Verwendung eines Lagerpuffers mit 50% Glycerin empfohlen.
- Zur Verdünnung der T4-DNA-Ligase für den sofortigen Gebrauch wird die Verwendung von 1x Reaktionspuffer empfohlen.

Für die PCR empfehlen wir unsere kostengünstige Taq DNA Polymerase S (M3001 >), oder unsere Pfu Proofreading Polymerase (M3004 >).

Anwendungen

• Klonierung von PCR-Produkten
• Klonierung von mit Restriktionsenzymen erzeugten DNA-Fragmenten
• Verbindung von doppelsträngigen Oligonukleotid-Linkern oder Adaptern mit DNA
• ortsspezifische Mutagenese
• Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
• Nick-Reparatur in Duplex-DNA, RNA oder DNA/RNA-Hybriden
• Selbstzirkulation linearer DNA.

Definition der T4-Ligase-Aktivität:

Es gibt 2 unterschiedliche Definitionen der Ligaseaktivität!

Eine Weiss unit ist definiert als Menge an Enzym die benötigt wird, um 1nmol mit 32P gelabeltes, anorganisches Pyroposphat in 20 Minuten bei 37°C in Norit* absorbierbares Material bei spezifischen Reaktionsbedingungen zu konvertieren (Weiss, B., et al., (1968) J. Biol. Chem., 243, 4543). *Norit ist eine Art aktivierter Kohlenstoff.

A Cohesive End Unit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 50% der Hind-III-Fragmente der Lambda-DNA (5'-DNA-Termini-Konzentration von 0,12µM (300µg/mL)) in 20µL 1X T4-DNA-Ligasepuffer in 30 Minuten bei 16 °C zu ligieren.

Der Umrechnungsfaktor zwischen den beiden Aktivitäten ist: Eine Cohesive End Ligation units (CEL units) entspricht 0,015 Weiss units. Eine Weiss unit entspricht somit 66,67 Cohesive End Ligation units (CEL units).