Multiplex HS MasterMix (2X)

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Produktinformationen "Multiplex HS MasterMix (2X)"

Multiplex-PCR ist eine Methode, mit der zwei oder mehr Amplifikate gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäß / einer einzigen Reaktion amplifiziert werden können. Es ist weit verbreitet in der Genotypisierung und in verschiedenen Bereichen der DNA-Testung in Forschungs-, Forensik- und Diagnoselabors.

Unser Multiplex HS Mastermix (2X) ist ein gebrauchsfertiger PCR-Mastermix der die gleichzeitige Amplifikation mehrerer PCR-Produkte erleichtert und dadurch die Entwicklung von Multiplex-PCR-Assays schnell und einfach macht. Der 2-fach Mastermix ist ein optimiertes, gebrauchsfertiges Gemisch für sondenbasierte Assays wie TaqMan®, Beacons und MGBs. Es enthält eine modifizierte HotStart Taq-DNA-Polymerase, dNTPs und MgCl2 kombiniert in einem optimierten Puffersystem für Echtzeit-PCR / qPCR-Anwendungen. Primer, Sonden und Matrizen-DNA / cDNA sind nicht enthalten.

Die im Multiplex HS enthaltene HotStart Taq-Polymerase basiert auf der Standard-Taq-DNA-Polymerase von Genaxxon, die durch einen spezifischen Antikörper inaktiviert wurde. Während der ersten Denaturierungsphase wird der Antikörper denaturiert und dadurch die Taq wieder aktiviert. Das Ergebnis ist eine höhere Spezifität, eine höhere Empfindlichkeit und höhere Ausbeuten im Vergleich zu Standard-DNA-Polymerasen, wodurch dieses Enzym besonders gut für die Multiplex-PCR geeignet ist.

- Amplifikation von unterschiedlichen Targets in einem einzigen PCR-Tube.
- All-in-one Mastermix für das leichte multiplexen.
- Hohe Spezifität, Sensitivität und Produktausbeute.
- Einfaches Set-up bei Raumtemperatur.

Der Multiplex HS MasterMix 2X wird in Aliqutos von 1mL angeboten.

Unsere Standard Agarose LE > und speziell unsere hochauflösende Spezialagarose Agarose Tiny > sind ideal dazu geeignet die PCR-Fragmente nach der Multiplex PCR zu analysieren.

Weitere realtime Mastermix /qPCR Mastermix können Sie hier > finden.

Beispiele für Multiplexandwendungen:
F. Javier Pérez-Pérez and Nancy D. Hanson, Detection of Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamase Genes in Clinical Isolates by Using Multiplex PCR, J. Clin. Microbiol. June 2002 vol. 40 no. 6 2153-2162. doi: 10.1128/JCM.40.6.2153-2162.2002.

Tamara B. Souzaa, Diego M. Lozerb, Sônia M. S. Kitagawab, Liliana C. Spanob, Neusa P. Silvac and Isabel C. A. Scaletskya, Real-Time Multiplex PCR Assay and Melting Curve Analysis for Identifying Diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. March 2013 vol. 51 no. 3 1031-1033, doi: 10.1128/JCM.02478-12.

FAQs

Die Hot Start-Modifikation der Polymerase hemmt ihre enzymatische Aktivität bei niedrigen Temperaturen und verhindert unspezifische Amplifikationen in den ersten PCR-Zyklen, die die qPCR-Ergebnisse drastisch beeinträchtigen können.

Der Ct-Wert (Threshold Cycle) in der qPCR ist ein Maß für die Genexpression und wird anhand der Fluoreszenzkurve bestimmt. Mit der Methode der zweiten Ableitung wird die maximale Änderung der zweiten Ableitung der Fluoreszenzkurve bestimmt - d. h. der Punkt, an dem die Fluoreszenzänderung nicht mehr ansteigt - und somit die exponentielle Amplifikation beendet ist. Der Zyklus, in dem dies der Fall ist, wird als "Quantifizierungszyklus (Cq)" bezeichnet. Bitte beachten Sie, dass die Berechnung des Cq-Wertes auch mit anderen Methoden durchgeführt werden kann. Es ist wichtig, dass Sie immer die gleiche Methode für Ihr Experiment verwenden.

ROX (5-Carboxy-Rhodamin-X) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, den einige qPCR-Geräte als passiven Referenzfarbstoff verwenden. Dies geschieht, um Fluoreszenzschwankungen zwischen den Vertiefungen auszugleichen, die durch Faktoren wie Materialinkonsistenzen oder ungenaues Pipettieren entstehen können. Im Allgemeinen ist es ratsam, diese Normalisierungsoption zu nutzen, wann immer dies möglich ist.

Es ist wichtig festzustellen, ob Ihr System eine niedrige (niedrige ROX) oder hohe (hohe ROX) ROX-Konzentration benötigt. Wenn Ihr Cycler jedoch keine ROX-Option hat, brauchen Sie sich keine Sorgen zu machen. Eine gut optimierte qPCR erfordert normalerweise keine zusätzliche Normalisierung durch einen passiven Farbstoff.

Genaxxon bietet qPCR-Mastermixe mit ROX-Konzentrationen an, die von keiner über eine niedrige bis hin zu einer hohen Konzentration reichen und alle Ihre Bedürfnisse abdecken.

Ja, die verwendeten Platten und Folien können die Testleistung beeinflussen, wie mehrere wissenschaftliche Studien belegen (z. B. Reiter und Pfaffl 2008: Effects of Plate Position, Plate Type and Sealing Systems on Real-Time PCR Results, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 22:3, 824-828, DOI: 10.1080/13102818.2008.10817561).

Im Allgemeinen haben weiße qPCR-Platten (z. B. die I2017 von Genaxxon) eine geringere Lichtstreuung und damit eine höhere Signalstärke als transparente qPCR-Platten (z. B. die I2004, I2010, I2031 von Genaxxon). Wenn Sie ein schwach exprimiertes Target oder nur geringe Mengen an Probenmaterial haben, empfehlen wir die Verwendung einer weißen qPCR-Platte.

Darüber hinaus ist es wichtig, optisch klare Folien für Ihre qPCR zu verwenden. Von der Verwendung "normaler" PCR-Folien raten wir ab, da Klebstoffreste und Transparenzunterschiede im Material zu Inhomogenitäten während Ihres qPCR-Assays führen können. Genaxxon bietet verschiedene qPCR-Folien an: eine stark haftende Folie (I2012), die die Platte sofort sicher versiegelt, und eine druckempfindliche Folie (I2248), die durch starken Druck auf der Platte haftet.

TaqMan-Sonden sind Hydrolyse-Sonden, die in der qPCR zur Messung von DNA-Konzentrationen verwendet werden. Hydrolyse-Sonden sind einzelsträngige DNA-Oligonukleotide, die an einem Ende mit einem Fluoreszenzmarker und am anderen Ende mit einem Quencher markiert sind. Der Quencher ist ein Molekül, das die Fluoreszenz des Markers unterdrückt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe befinden. Wenn die Sonde an das DNA-Ziel bindet und die Polymerase die Amplifikation einleitet, spaltet ihre Exonukleaseaktivität sowohl den fluoreszierenden Marker als auch den Quencher. Durch diesen Vorgang wird die hemmende Wirkung des Quenchers aufgehoben. Da sich dieser Vorgang in jedem Zyklus wiederholt, ist die Stärke des Fluoreszenzsignals, das nach der Anregung gemessen wird, direkt proportional zur Menge der amplifizierten DNA.

Hydrolyse-Sonden (TaqMan) eignen sich hervorragend für Anwendungen wie die SNP-Genotypisierung, die Analyse von Spleißvarianten und den Nachweis von Mutationen mittels qPCR. Im Gegensatz dazu sind SYBRGreen-basierte Assays ideal für Genexpressions- oder miRNA-Expressionsanalysen und bieten zusätzliche Vorteile, einschließlich Qualitätsmetriken wie Schmelzkurvenanalyse. M

Mehrere wissenschaftliche Studien deuten darauf hin, dass ein ordnungsgemäß optimierter SYBRGreen-Assay für die Genexpressionsanalyse ebenso effektiv ist wie eine Hydrolyse-Sonde (TaqMan) (z. B. Tajadini et. al. 2014: Comparison of SYBR Green and TaqMan® methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes, Advanced Biomedical Research, 3, 85, DOI: 10.4103/2277-9175.127998).

Zu den Schlüsselfaktoren für den Erfolg gehören in beiden Fällen die Auswahl geeigneter Primer, die Optimierung des qPCR-Mastermixes und die Sicherstellung qualitativ hochwertiger, nicht fragmentierter cDNA, die auch für TaqMan-Sonden entscheidend ist. Bitte beachten Sie, dass die Leistung eines qPCR-Assays mit (TaqMan-)Sonden stark von der Amplikonlänge beeinflusst wird, was sich auf seine Robustheit, Sensitivität und Spezifität auswirkt. Im Gegensatz dazu weist ein Assay mit SYBRGreen eine größere Toleranz gegenüber Variationen der Amplikonlänge auf.

Um die Spezifität zu testen, können Sie eine post-qPCR-Analyse durchführen, indem Sie die Reaktionsmischung entweder auf einem Agarosegel laufen lassen oder, wenn Sie SYBRGreen verwenden, eine Schmelzkurve erstellen. Diese Methoden zeigen schnell das Vorhandensein von unbeabsichtigten Nebenprodukten an.

Wie bei jedem Experiment ist es entscheidend, die richtigen Kontrollen in jeden qPCR-Assay einzubeziehen. Je nach Assay-Format empfehlen wir die folgenden Kontrollen:

No-Template Control (NTC): Für jedes zu analysierende Gen ist es wichtig, eine NTC zu verwenden (einfach Wasser anstelle eines Templates). NTCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von Kreuzkontaminationen und sollten ein Standardbestandteil jeder qPCR sein.
Referenzgene (früher bekannt als Housekeeping-Gene): Um eine robuste Genexpressionsanalyse zu gewährleisten, ist es eine gute Praxis, mehrere Referenzgene für jede Probe zu verwenden. Diese Referenzgene sollten unabhängig von der Behandlung eine stabile Expression aufweisen und als Referenzpunkte für die anschließende relative Quantifizierung dienen.
Alternative Positivkontrolle: In Fällen, in denen Sie absolute Quantifizierungen durchführen und keine Referenzgene verwenden, wird die Einbeziehung einer alternativen Positivkontrolle empfohlen. Diese Kontrolle sollte in allen Szenarien stets ein bekanntes Ergebnis liefern.
noRT-Kontrolle: Wenn Sie die reverse Transkription (RT) von mRNA als Vorlage verwenden, ist es ratsam, eine noRT-Kontrolle mit einer Probe ohne das Enzym durchzuführen.

Bitte beachten Sie, dass eine Schmelzkurvenanalyse nur möglich ist, wenn eine qPCR mit interkalierenden Farbstoffen, z. B. SYBRGreen, durchgeführt wird, nicht aber mit Sonden.

Die Schmelzkurve kann verwendet werden, um die Spezifität einer qPCR zu bestimmen und um eventuell auftretende Nebenprodukte zu erkennen. Es wird daher dringend empfohlen, für jede qPCR eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, wenn ein interkalierender Farbstoff verwendet wird.

Um die Schmelzkurve zu erstellen, erhöht der qPCR-Cycler kontinuierlich die Temperatur und misst gleichzeitig die Fluoreszenz. Diese fällt ab, sobald die Schmelztemperatur des während der qPCR produzierten Amplikons überschritten wird.

Warum ist das so? Wenn das Produkt schmilzt, wird der interkalierende Farbstoff freigesetzt, wodurch das Fluoreszenzsignal abfällt. Normalerweise wird die Schmelzkurve nicht direkt als Fluoreszenzkurve dargestellt, sondern als Funktion der Fluoreszenzänderung. Eine starke Veränderung der Fluoreszenz wird als Peak dargestellt (Amplikons denaturieren in diesem Bereich).

Bitte beachten Sie, dass eine qPCR immer nur einen einzigen Peak anzeigt. Mehrere Peaks sind - mit Ausnahme von Multiplex-Assays! - ein deutlicher Hinweis auf unerwünschte Nebenprodukte. Diese können unter Umständen das Ergebnis komplett verfälschen und unbrauchbar machen.

Bitte beachten Sie: Wenn Sie Ihren Mastermix ändern, kann sich der Peak einer Schmelzkurve verschieben. Warum ist das so? Die Schmelztemperatur hängt auch von dem im Mastermix verwendeten Puffer ab, insbesondere von der Salzkonzentration. Da verschiedene Mastermixe unterschiedliche Puffer verwenden können, ist es sehr wahrscheinlich, dass die resultierende Schmelzkurve abweicht.

Die Primerkonzentration spielt eine entscheidende Rolle für die qPCR-Leistung und sollte sorgfältig optimiert werden. Eine zu hohe oder zu niedrige Primerkonzentration kann sich negativ auf die Berechnung des Cq-Wertes auswirken und sogar die Bildung von Primer-Dimeren fördern (siehe z. B. Mikeska und Dobrovic 2009: Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription - quantitative real-time PCR assays, BMC Research Notes, 2, 112, DOI: 10.1186/1756-0500-2-112). Als allgemeine Richtlinie können Sie mit einer Primerkonzentration von 100-200 nM beginnen. Es ist jedoch wichtig, Testassays sowohl mit höheren als auch mit niedrigeren Konzentrationen durchzuführen, um den optimalen Bereich zu ermitteln.

Die genaue Menge des Templates, die für eine bestimmte qPCR benötigt wird, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Eine zu große Template-Menge kann die qPCR möglicherweise hemmen. Bei einer typischen qPCR liegt der Bereich für den Template-Verbrauch pro Reaktion zwischen 1 und 10 ng. Daher ist es sehr empfehlenswert, zu Beginn der qPCR-Optimierung eine Template-Verdünnungsreihe zu erstellen, die 5 bis 6 Größenordnungen abdeckt. Dieser Schritt ist entscheidend für die Bestimmung der optimalen Template-Menge. Diese Verdünnungsreihe hilft bei der Bestimmung der Primereffizienz, des Potenzials für eine qPCR-Inhibierung durch das Template und der Überprüfung, ob die Template-Menge in den linearen Bereich der qPCR fällt. Sobald diese Parameter festgelegt sind, können Sie mit Zuversicht eine Template-Menge auswählen, die mit dem linearen Bereich der qPCR übereinstimmt.

Die Spezifität eines qPCR-Assays hängt von mehreren Faktoren ab, u. a. von der Primerkonzentration, der Schmelztemperatur der Primer, der Annealing-Temperatur und Annealing-Zeit sowie von der möglichen Bildung von Primer-Dimeren. Wenn Ihr qPCR-Assay nicht die gewünschte Spezifität aufweist, empfehlen wir folgende Maßnahmen:

Reduzieren Sie die Primerkonzentration.
Erhöhen Sie die Annealing-Temperatur (und achten Sie darauf, dass sie die Schmelztemperatur der Primer nicht überschreitet).
Verkürzen Sie die Annealing-Zeit.

Wenn sich keine dieser Maßnahmen als wirksam erweist, sollten Sie ein Re-Design der Primer in Erwägung ziehen und verschiedene Optionen für Länge, Schmelztemperatur und Sequenz untersuchen.

SybrGreen hat nur eine geringe Spezifität. Es bindet während der PCR-Zyklen an doppelsträngige DNA, auch an potenziell unspezifische Reaktionsprodukte. Dies führt zu ungenauen qPCR-Ergebnissen bei nicht optimierten Protokollen. Um spezifischere Ergebnisse zu erhalten, sollte eine sondenbasierte qPCR durchgeführt werden.

Die Mastermixe verschiedener Hersteller haben unterschiedliche Zusammensetzungen, auch die Puffer. Einige Assays reagieren empfindlich auf diese Abweichungen, so dass unterschiedliche Ergebnisse möglich sind. Daher ist bei einem Wechsel des Mastermixes immer eine Kalibrierung erforderlich. Wenn Sie weitere Fragen haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Bei den von Genaxxon bereitgestellten Protokollen handelt es sich um Standardprotokolle. Um eine optimale Spezifität und Amplifikation zu erreichen, wird eine individuelle Optimierung der Versuchsbedingungen empfohlen. Sollten Sie weitere Fragen dazu haben, können Sie sich gerne an unseren technischen Support wenden: info@genaxxon.com.

Ob Sie einen passiven Referenzfarbstoff wie ROX verwenden müssen, hängt von Ihrem qPCR-Gerät ab. Daher bietet Genaxxon qPCR-Mastermixe an, die entweder keine oder geringe und hohe Mengen des passiven Referenzfarbstoffs RO enthalten, um die Kompatibilität mit einer Vielzahl von qPCR-Geräten zu gewährleisten. Wenn Sie Probleme bei der Auswahl des richtigen Mastermixes für Ihre Anwendung haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Genaxxon bietet verschiedene qPCR-Mastermixe an, die für FAST-qPCR-Assays optimiert sind. Je nach Bedarf bietet Genaxxon Mastermixe für FAST-qPCR-Assays mit (GreenMasterMix FAST) oder ohne (ProbeMasterMix FAST) Fluoreszenzfarbstoff und ohne (No ROX) oder mit einem passiven Referenzfarbstoff in verschiedenen Konzentrationen (Low ROX oder High ROX) an. Wenn Sie Probleme bei der Auswahl des richtigen Mastermixes für Ihre Anwendung haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Ja, Sie können während Ihres Projekts oder sogar mitten im Experiment zu einem anderen qPCR-Mastermix wechseln! Sie müssen nur vorher eine Normalisierung Ihrer qPCR durchführen. Bitte beachten Sie, dass wir generell eine Normalisierung für jede qPCR empfehlen. Prüfen Sie auch, ob Sie die Einstellungen Ihres PCR-Cyclers anpassen müssen, wenn Sie den Mastermix wechseln.

Ja, alle qPCR-Master-Mixe von Genaxxon können für Multiplex-Anwendungen verwendet werden. Für eine einfache und schnelle Optimierung Ihrer Multiplex-Reaktion empfehlen wir jedoch die Verwendung eines unserer speziell entwickelten Multiplex-Mastermixe, z. B. 5X qPCR Multiplex MasterMix (M3024), Multiplex HS MasterMix (2X) (M3013) oder den lyophilisierten LyoPlex Multiplex PCR MasterMix (M3005).

Specifications:
2-time ready-to-use multiplex master mix with an optimized modified Taq DNA polymerase without green fluorescent dye and without ROX™.

Applikation / Application:

Automated hotstart PCR Gene expression Multiplex qPCR / Multiplex PCR with fluorochromes Genotyping Copy number analysis

Einheiten / Units:

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.

Quelle / Source:

synthetic

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

eclass-Nr: 32-16-05-02

Dokumente - Protokolle - Downloads :

Hier finden Sie Informationen und weiterführende Literatur. Für weitere Dokumente (Zertifikate mit weiteren Lotnummern, Sicherheitsdatenblätter in anderer Sprache, weitere Produktinformationen) wenden Sie sich bitte an Genaxxon biosience unter: info@genaxxon.com oder Tel.: +49 731 3608 123.

Dokumente:

Datenblätter
Allg. Daten 4
Kategorienliste