GreenMasterMix (2X) ohne ROX für die qPCR

Genaxxon bioscience

realtime PCR master mix without ROX from Genaxxon

GreenMasterMix FAST Low ROX für die qPCR

Vorteile im Überblick

Enthält interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff und KEIN ROX
Hervorragende Effizienz und Spezifität
Effektive Amplifikation auch von GC-reichen DNA-Sequenzen
Hotstarttechnologie verhindert Primerdimer-Bildung, erfordert kein Pipettieren auf Eis und kein sofortiges Weiterverarbeiten
Ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von bis zu vier DNA-Targets in einer einzigen Multiplex-PCR-Reaktion

115,00 €*

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Volumen

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Produktnummer: M3023.0100
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Produktinformationen "GreenMasterMix (2X) ohne ROX für die qPCR"

Green qPCR Mastermix ohne ROX optimiert für die qPCR/realtime PCR in Blockgeräten. Der Green qPCR Mastermix ohne ROX enthält einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff und alle notwendigen Komponenten in einer optimierten Menge, um eine quantitative PCR durchzuführen.

Vorteile der im Genaxxon GreenMasterMix eingesetzten chemisch modifizierten SuperHot Taq-Polymerase:

Hotstarttechnologie für das Setup bei Raumtemperatur
Kein Pipettieren auf Eis notwendig
Kein sofortiges Weiterbearbeiten (PCR) notwendig. Die pipettierten PCR-Ansätze können bis zu 3 Tagen bei RT stehengelassen werden.
Amplifikation auch von GC-reichen Templates
Hohe Ausbeute
Keine Primerdimerbildung

Die Genaxxon SuperHot Taq DNA-Polymerase bietet Komfort und Praktikabilität für konstante Effizienz und Spezifität:
1. Sie inhibiert die Polymerase bei niedrigen Temperaturen und verhindert so zuverlässig unspezifische PCR-Reaktionen. Daher muss das PCR Setup nicht auf Eis durchgeführt werden.
2. Dies führt dazu, dass der PCR-Ansatz bei RT (20°C bis 25°C) zusammengemischt und bis zu 3 Tage gelagert werden kann, ohne das Endergebnis zu beeinflussen (z.B. während der Mittagspause oder während des Wartens auf weitere Proben).

Der Green qPCR Mastermix ohne ROX enthält alle notwendigen Komponenten in einer optimierten Menge, um eine quantitative PCR durchzuführen.

chemisch modifizierte Taq DNA Polymerase
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
interkalierender, grüner Fluoreszenzfarbstoff
optimierter Reaktionspuffer
Stabilisator und Enhancer, um sogar die Amplifikation von low copy number Targets zu ermöglichen
Die kleinen Aliquots von 1,25mL vereinfachen die Handhabung und die Lagerung (weniger Einfrier- und Auftauzyklen pro Aliquot).

Stabilität bei +2°C bis +8°C (Kühlschrank): Mindestens 8 Monate.

Speziell geeignet für: BioRad CFX96 Touch™, CFX384 Touch™, CFX Connect™, DNA Engine Opticon® 2, Chromo4™, iCycler iQ™ and My iQ™ , Roche LightCycler® 480, LightCycler® 1536, LightCycler® Nano, LightCycler® 96 and QuantStudio™ instruments, Thermo Scientific™ PikoReal™, Cepheid SmartCycler®, Bio Molecular Systems Mic qPCR cycler, Qiagen Rotor Gene Q, Rotor Gene 6000, MyGo Mini and MyGo Pro.

Weitere realtime PCR Mastermixe und realtime FAST PCR Mastermixe finden Sie hier: qPCR (Classic qPCR > oder FAST und Multiplex qPCR >).

Unsere Daten zeigen, dass die Genaxxon Probe- und GreenMastermixe vergleichbare Ergebnisse zu entsprechenden qPCR Mastermixen von Wettbewerbern liefern.

Testmuster sind erhältlich! Keine Versandkosten bei Versand innerhalb Deutschlands!

FAQs

Die Hot Start-Modifikation der Polymerase hemmt ihre enzymatische Aktivität bei niedrigen Temperaturen und verhindert unspezifische Amplifikationen in den ersten PCR-Zyklen, die die qPCR-Ergebnisse drastisch beeinträchtigen können.

Der Ct-Wert (Threshold Cycle) in der qPCR ist ein Maß für die Genexpression und wird anhand der Fluoreszenzkurve bestimmt. Mit der Methode der zweiten Ableitung wird die maximale Änderung der zweiten Ableitung der Fluoreszenzkurve bestimmt - d. h. der Punkt, an dem die Fluoreszenzänderung nicht mehr ansteigt - und somit die exponentielle Amplifikation beendet ist. Der Zyklus, in dem dies der Fall ist, wird als "Quantifizierungszyklus (Cq)" bezeichnet. Bitte beachten Sie, dass die Berechnung des Cq-Wertes auch mit anderen Methoden durchgeführt werden kann. Es ist wichtig, dass Sie immer die gleiche Methode für Ihr Experiment verwenden.

ROX (5-Carboxy-Rhodamin-X) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, den einige qPCR-Geräte als passiven Referenzfarbstoff verwenden. Dies geschieht, um Fluoreszenzschwankungen zwischen den Vertiefungen auszugleichen, die durch Faktoren wie Materialinkonsistenzen oder ungenaues Pipettieren entstehen können. Im Allgemeinen ist es ratsam, diese Normalisierungsoption zu nutzen, wann immer dies möglich ist.

Es ist wichtig festzustellen, ob Ihr System eine niedrige (niedrige ROX) oder hohe (hohe ROX) ROX-Konzentration benötigt. Wenn Ihr Cycler jedoch keine ROX-Option hat, brauchen Sie sich keine Sorgen zu machen. Eine gut optimierte qPCR erfordert normalerweise keine zusätzliche Normalisierung durch einen passiven Farbstoff.

Genaxxon bietet qPCR-Mastermixe mit ROX-Konzentrationen an, die von keiner über eine niedrige bis hin zu einer hohen Konzentration reichen und alle Ihre Bedürfnisse abdecken.

Ja, die verwendeten Platten und Folien können die Testleistung beeinflussen, wie mehrere wissenschaftliche Studien belegen (z. B. Reiter und Pfaffl 2008: Effects of Plate Position, Plate Type and Sealing Systems on Real-Time PCR Results, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 22:3, 824-828, DOI: 10.1080/13102818.2008.10817561).

Im Allgemeinen haben weiße qPCR-Platten (z. B. die I2017 von Genaxxon) eine geringere Lichtstreuung und damit eine höhere Signalstärke als transparente qPCR-Platten (z. B. die I2004, I2010, I2031 von Genaxxon). Wenn Sie ein schwach exprimiertes Target oder nur geringe Mengen an Probenmaterial haben, empfehlen wir die Verwendung einer weißen qPCR-Platte.

Darüber hinaus ist es wichtig, optisch klare Folien für Ihre qPCR zu verwenden. Von der Verwendung "normaler" PCR-Folien raten wir ab, da Klebstoffreste und Transparenzunterschiede im Material zu Inhomogenitäten während Ihres qPCR-Assays führen können. Genaxxon bietet verschiedene qPCR-Folien an: eine stark haftende Folie (I2012), die die Platte sofort sicher versiegelt, und eine druckempfindliche Folie (I2248), die durch starken Druck auf der Platte haftet.

TaqMan-Sonden sind Hydrolyse-Sonden, die in der qPCR zur Messung von DNA-Konzentrationen verwendet werden. Hydrolyse-Sonden sind einzelsträngige DNA-Oligonukleotide, die an einem Ende mit einem Fluoreszenzmarker und am anderen Ende mit einem Quencher markiert sind. Der Quencher ist ein Molekül, das die Fluoreszenz des Markers unterdrückt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe befinden. Wenn die Sonde an das DNA-Ziel bindet und die Polymerase die Amplifikation einleitet, spaltet ihre Exonukleaseaktivität sowohl den fluoreszierenden Marker als auch den Quencher. Durch diesen Vorgang wird die hemmende Wirkung des Quenchers aufgehoben. Da sich dieser Vorgang in jedem Zyklus wiederholt, ist die Stärke des Fluoreszenzsignals, das nach der Anregung gemessen wird, direkt proportional zur Menge der amplifizierten DNA.

Hydrolyse-Sonden (TaqMan) eignen sich hervorragend für Anwendungen wie die SNP-Genotypisierung, die Analyse von Spleißvarianten und den Nachweis von Mutationen mittels qPCR. Im Gegensatz dazu sind SYBRGreen-basierte Assays ideal für Genexpressions- oder miRNA-Expressionsanalysen und bieten zusätzliche Vorteile, einschließlich Qualitätsmetriken wie Schmelzkurvenanalyse. M

Mehrere wissenschaftliche Studien deuten darauf hin, dass ein ordnungsgemäß optimierter SYBRGreen-Assay für die Genexpressionsanalyse ebenso effektiv ist wie eine Hydrolyse-Sonde (TaqMan) (z. B. Tajadini et. al. 2014: Comparison of SYBR Green and TaqMan® methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes, Advanced Biomedical Research, 3, 85, DOI: 10.4103/2277-9175.127998).

Zu den Schlüsselfaktoren für den Erfolg gehören in beiden Fällen die Auswahl geeigneter Primer, die Optimierung des qPCR-Mastermixes und die Sicherstellung qualitativ hochwertiger, nicht fragmentierter cDNA, die auch für TaqMan-Sonden entscheidend ist. Bitte beachten Sie, dass die Leistung eines qPCR-Assays mit (TaqMan-)Sonden stark von der Amplikonlänge beeinflusst wird, was sich auf seine Robustheit, Sensitivität und Spezifität auswirkt. Im Gegensatz dazu weist ein Assay mit SYBRGreen eine größere Toleranz gegenüber Variationen der Amplikonlänge auf.

Um die Spezifität zu testen, können Sie eine post-qPCR-Analyse durchführen, indem Sie die Reaktionsmischung entweder auf einem Agarosegel laufen lassen oder, wenn Sie SYBRGreen verwenden, eine Schmelzkurve erstellen. Diese Methoden zeigen schnell das Vorhandensein von unbeabsichtigten Nebenprodukten an.

Wie bei jedem Experiment ist es entscheidend, die richtigen Kontrollen in jeden qPCR-Assay einzubeziehen. Je nach Assay-Format empfehlen wir die folgenden Kontrollen:

No-Template Control (NTC): Für jedes zu analysierende Gen ist es wichtig, eine NTC zu verwenden (einfach Wasser anstelle eines Templates). NTCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von Kreuzkontaminationen und sollten ein Standardbestandteil jeder qPCR sein.
Referenzgene (früher bekannt als Housekeeping-Gene): Um eine robuste Genexpressionsanalyse zu gewährleisten, ist es eine gute Praxis, mehrere Referenzgene für jede Probe zu verwenden. Diese Referenzgene sollten unabhängig von der Behandlung eine stabile Expression aufweisen und als Referenzpunkte für die anschließende relative Quantifizierung dienen.
Alternative Positivkontrolle: In Fällen, in denen Sie absolute Quantifizierungen durchführen und keine Referenzgene verwenden, wird die Einbeziehung einer alternativen Positivkontrolle empfohlen. Diese Kontrolle sollte in allen Szenarien stets ein bekanntes Ergebnis liefern.
noRT-Kontrolle: Wenn Sie die reverse Transkription (RT) von mRNA als Vorlage verwenden, ist es ratsam, eine noRT-Kontrolle mit einer Probe ohne das Enzym durchzuführen.

Bitte beachten Sie, dass eine Schmelzkurvenanalyse nur möglich ist, wenn eine qPCR mit interkalierenden Farbstoffen, z. B. SYBRGreen, durchgeführt wird, nicht aber mit Sonden.

Die Schmelzkurve kann verwendet werden, um die Spezifität einer qPCR zu bestimmen und um eventuell auftretende Nebenprodukte zu erkennen. Es wird daher dringend empfohlen, für jede qPCR eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, wenn ein interkalierender Farbstoff verwendet wird.

Um die Schmelzkurve zu erstellen, erhöht der qPCR-Cycler kontinuierlich die Temperatur und misst gleichzeitig die Fluoreszenz. Diese fällt ab, sobald die Schmelztemperatur des während der qPCR produzierten Amplikons überschritten wird.

Warum ist das so? Wenn das Produkt schmilzt, wird der interkalierende Farbstoff freigesetzt, wodurch das Fluoreszenzsignal abfällt. Normalerweise wird die Schmelzkurve nicht direkt als Fluoreszenzkurve dargestellt, sondern als Funktion der Fluoreszenzänderung. Eine starke Veränderung der Fluoreszenz wird als Peak dargestellt (Amplikons denaturieren in diesem Bereich).

Bitte beachten Sie, dass eine qPCR immer nur einen einzigen Peak anzeigt. Mehrere Peaks sind - mit Ausnahme von Multiplex-Assays! - ein deutlicher Hinweis auf unerwünschte Nebenprodukte. Diese können unter Umständen das Ergebnis komplett verfälschen und unbrauchbar machen.

Bitte beachten Sie: Wenn Sie Ihren Mastermix ändern, kann sich der Peak einer Schmelzkurve verschieben. Warum ist das so? Die Schmelztemperatur hängt auch von dem im Mastermix verwendeten Puffer ab, insbesondere von der Salzkonzentration. Da verschiedene Mastermixe unterschiedliche Puffer verwenden können, ist es sehr wahrscheinlich, dass die resultierende Schmelzkurve abweicht.

Die Primerkonzentration spielt eine entscheidende Rolle für die qPCR-Leistung und sollte sorgfältig optimiert werden. Eine zu hohe oder zu niedrige Primerkonzentration kann sich negativ auf die Berechnung des Cq-Wertes auswirken und sogar die Bildung von Primer-Dimeren fördern (siehe z. B. Mikeska und Dobrovic 2009: Validation of a primer optimisation matrix to improve the performance of reverse transcription - quantitative real-time PCR assays, BMC Research Notes, 2, 112, DOI: 10.1186/1756-0500-2-112). Als allgemeine Richtlinie können Sie mit einer Primerkonzentration von 100-200 nM beginnen. Es ist jedoch wichtig, Testassays sowohl mit höheren als auch mit niedrigeren Konzentrationen durchzuführen, um den optimalen Bereich zu ermitteln.

Die genaue Menge des Templates, die für eine bestimmte qPCR benötigt wird, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Eine zu große Template-Menge kann die qPCR möglicherweise hemmen. Bei einer typischen qPCR liegt der Bereich für den Template-Verbrauch pro Reaktion zwischen 1 und 10 ng. Daher ist es sehr empfehlenswert, zu Beginn der qPCR-Optimierung eine Template-Verdünnungsreihe zu erstellen, die 5 bis 6 Größenordnungen abdeckt. Dieser Schritt ist entscheidend für die Bestimmung der optimalen Template-Menge. Diese Verdünnungsreihe hilft bei der Bestimmung der Primereffizienz, des Potenzials für eine qPCR-Inhibierung durch das Template und der Überprüfung, ob die Template-Menge in den linearen Bereich der qPCR fällt. Sobald diese Parameter festgelegt sind, können Sie mit Zuversicht eine Template-Menge auswählen, die mit dem linearen Bereich der qPCR übereinstimmt.

Die Spezifität eines qPCR-Assays hängt von mehreren Faktoren ab, u. a. von der Primerkonzentration, der Schmelztemperatur der Primer, der Annealing-Temperatur und Annealing-Zeit sowie von der möglichen Bildung von Primer-Dimeren. Wenn Ihr qPCR-Assay nicht die gewünschte Spezifität aufweist, empfehlen wir folgende Maßnahmen:

Reduzieren Sie die Primerkonzentration.
Erhöhen Sie die Annealing-Temperatur (und achten Sie darauf, dass sie die Schmelztemperatur der Primer nicht überschreitet).
Verkürzen Sie die Annealing-Zeit.

Wenn sich keine dieser Maßnahmen als wirksam erweist, sollten Sie ein Re-Design der Primer in Erwägung ziehen und verschiedene Optionen für Länge, Schmelztemperatur und Sequenz untersuchen.

SybrGreen hat nur eine geringe Spezifität. Es bindet während der PCR-Zyklen an doppelsträngige DNA, auch an potenziell unspezifische Reaktionsprodukte. Dies führt zu ungenauen qPCR-Ergebnissen bei nicht optimierten Protokollen. Um spezifischere Ergebnisse zu erhalten, sollte eine sondenbasierte qPCR durchgeführt werden.

Die Mastermixe verschiedener Hersteller haben unterschiedliche Zusammensetzungen, auch die Puffer. Einige Assays reagieren empfindlich auf diese Abweichungen, so dass unterschiedliche Ergebnisse möglich sind. Daher ist bei einem Wechsel des Mastermixes immer eine Kalibrierung erforderlich. Wenn Sie weitere Fragen haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Bei den von Genaxxon bereitgestellten Protokollen handelt es sich um Standardprotokolle. Um eine optimale Spezifität und Amplifikation zu erreichen, wird eine individuelle Optimierung der Versuchsbedingungen empfohlen. Sollten Sie weitere Fragen dazu haben, können Sie sich gerne an unseren technischen Support wenden: info@genaxxon.com.

Ob Sie einen passiven Referenzfarbstoff wie ROX verwenden müssen, hängt von Ihrem qPCR-Gerät ab. Daher bietet Genaxxon qPCR-Mastermixe an, die entweder keine oder geringe und hohe Mengen des passiven Referenzfarbstoffs RO enthalten, um die Kompatibilität mit einer Vielzahl von qPCR-Geräten zu gewährleisten. Wenn Sie Probleme bei der Auswahl des richtigen Mastermixes für Ihre Anwendung haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Genaxxon bietet verschiedene qPCR-Mastermixe an, die für FAST-qPCR-Assays optimiert sind. Je nach Bedarf bietet Genaxxon Mastermixe für FAST-qPCR-Assays mit (GreenMasterMix FAST) oder ohne (ProbeMasterMix FAST) Fluoreszenzfarbstoff und ohne (No ROX) oder mit einem passiven Referenzfarbstoff in verschiedenen Konzentrationen (Low ROX oder High ROX) an. Wenn Sie Probleme bei der Auswahl des richtigen Mastermixes für Ihre Anwendung haben, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Support: info@genaxxon.com.

Ja, Sie können während Ihres Projekts oder sogar mitten im Experiment zu einem anderen qPCR-Mastermix wechseln! Sie müssen nur vorher eine Normalisierung Ihrer qPCR durchführen. Bitte beachten Sie, dass wir generell eine Normalisierung für jede qPCR empfehlen. Prüfen Sie auch, ob Sie die Einstellungen Ihres PCR-Cyclers anpassen müssen, wenn Sie den Mastermix wechseln.

Ja, alle qPCR-Master-Mixe von Genaxxon können für Multiplex-Anwendungen verwendet werden. Für eine einfache und schnelle Optimierung Ihrer Multiplex-Reaktion empfehlen wir jedoch die Verwendung eines unserer speziell entwickelten Multiplex-Mastermixe, z. B. 5X qPCR Multiplex MasterMix (M3024), Multiplex HS MasterMix (2X) (M3013) oder den lyophilisierten LyoPlex Multiplex PCR MasterMix (M3005).

Specifications:
This realtime PCR master mix is a ready-to-use 2-time master mix that contains no ROX™
Suited for FAST PCR with MIC Cycler

Aliquot size: 1.25mL. This master mix is stable for at least 8 months at +2°C to +8°C.

Applikation / Application:

PCR Primer extension Multiplex PCR Low-copy targets PCR Real-time PCR Quantitative PCR

Einheiten / Units:

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.

Quelle / Source:

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

eclass-Nr: 32-16-05-02

Dokumente - Protokolle - Downloads :

Hier finden Sie Informationen und weiterführende Literatur. Für weitere Dokumente (Zertifikate mit weiteren Lotnummern, Sicherheitsdatenblätter in anderer Sprache, weitere Produktinformationen) wenden Sie sich bitte an Genaxxon biosience unter: info@genaxxon.com oder Tel.: +49 731 3608 123.

Dokumente:

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Datenblätter
Spez. Produktbeschreibung
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Allg. Daten 2
Allg. Daten 3
Kategorienliste

Hier finden Sie Artikel und Literaturzitate, in denen die Autoren auf die hohe Qualität dieses Genaxxonprodukts vertrauen.
Quelle: NCBI PubMed

NOD1 cooperates with HAX-1 to promote cell migration in a RIPK2- and NF-ĸB-independent manner.
Lucy Hezinger, Sarah Bauer, Kornelia Ellwanger, Alban Piotrowsky, Felix Biber, Sascha Venturelli, Thomas A. Kufer
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Immunomodulatory role of reactive oxygen species and nitrogen species during T cell-driven neutrophil-enriched acute and chronic cutaneous delayed-type hypersensitivity reactions
Mehling R, Schwenck J, Lemberg C, Trautwein C, Zizmare L, Kramer D, Müller A, Fehrenbacher B, Gonzalez-Menendez I, Quintanilla-Martinez L, Schröder K, Brandes RP, Schaller M, Ruf W, Eichner M, Ghoreschi K, Röcken M, Pichler BJ, Kneilling M.
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Misexpression of a transcriptional repressor candidate provides a molecular mechanism for the suppression of awns by Tipped 1 in wheat.
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Serum protein levels of YKL-40 and plasma miR-214 expression in patients with Systemic sclerosis.
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Keratinocyte-derived IκBζ drives psoriasis and associated systemic inflammation
Sebastian Lorscheid, Anne Müller, Jessica Löffler, Claudia Resch, Philip Bucher, Florian C. Kurschus, Ari Waisman, Knut Schäkel, Stephan Hailfinger, Klaus Schulze-Osthoff, Daniela Kramer
JCI Insight. 2019 Nov 14; 4(22): e130835. Published online 2019 Nov 14. doi: 10.1172/jci.insight.130835
PMCID: PMC6948851

Long Noncoding RNA SSR42 Controls Staphylococcus aureus Alpha-Toxin Transcription in Response to Environmental Stimuli
Jessica Horn, Maximilian Klepsch, Michelle Manger, Christiane Wolz, Thomas Rudel, Martin Fraunholz
J Bacteriol. 2018 Nov 15; 200(22): e00252-18. Prepublished online 2018 Aug 27. Published online 2018 Oct 23. doi: 10.1128/JB.00252-18
PMCID: PMC6199474

MiR-744-5p inducing cell death by directly targeting HNRNPC and NFIX in ovarian cancer cells
Michael Kleemann, Helga Schneider, Kristian Unger, Philip Sander, E. Marion Schneider, Pamela Fischer-Posovszky, René Handrick, Kerstin Otte
Sci Rep. 2018; 8: 9020. Published online 2018 Jun 13. doi: 10.1038/s41598-018-27438-6
PMCID: PMC5998049

miR-217-5p induces apoptosis by directly targeting PRKCI, BAG3, ITGAV and MAPK1 in colorectal cancer cells
Marion Flum, Michael Kleemann, Helga Schneider, Benjamin Weis, Simon Fischer, René Handrick, Kerstin Otte
J Cell Commun Signal. 2018 Jun; 12(2): 451–466. Published online 2017 Sep 14. doi: 10.1007/s12079-017-0410-x
PMCID: PMC5910322

Investigation on tissue specific effects of pro-apoptotic micro RNAs revealed miR-147b as a potential biomarker in ovarian cancer prognosis.
Michael Kleemann, Jeremias Bereuther, Simon Fischer, Kim Marquart, Simon Hänle, Kristian Unger, Verena Jendrossek, Christian U Riedel, René Handrick, Kerstin Otte
Oncotarget. 2017 Mar 21;8(12):18773-18791.
doi: 10.18632/oncotarget.13095.
PMCID: PMC5386646.

Fast PCR:

When performing fast real-time PCR, it is of high importance to consider primer design and target size. For efficient amplification during fast cycling conditions, target size between 70 bp and 200 bp is recommended. The shorter the target length, the faster the total run time. For other targets and other primer sets, the annealing step has to be determined experimentally.

Please use the following protocol for inspiration as you need to optimize instruments settings according to yourr target size and applied instruments.

Fast real-time PCR results using Genaxxon Master Mixes (without ROX) on LightCycler® 96

GreenMasterMix (2X) without ROX or ProbeMasterMix (2X) without ROX was tested on LighCycler96 (Roche) using fast cycling real-time 2-step protocols; Fast PAH12 Green LC and Fast Pthr Probe LC, respectively.
qPCR Setup: GreenMasterMix (2X) (without ROX) or ProbeMasterMix (2X) (without ROX), primers targeting either PAH12 (203 bp) or Pthr (75 bp) and 4 concentrations of gDNA (40 ng, 20 ng, 10 ng and 5 ng) were used. All DNA concentrations were tested in quadruple replicates. See fig. 1 and 2. The PCR reaction mix was run on LightCycler® 96 (No requirements for ROX). Instrument settings, run times and quality criteria for the applied fast protocols; Fast PAH12 Green LC and Fast Pthr Probe LC, were compared to the standard protocol; Standard Pthr LC. See table 1.

Results: The standard Fast Pthr Probe LC protocol has a run time of 80.8 minutes. Fast PAH12 Green LC and Fast Pthr Probe LC protocols, resulted in run times of 47.5 and 40.8 minutes, respectively. All protocol times are inclusive ramping time and a15 minutes hot start. The determined criteria, as shown in table 1, for Fast PAH12 Green LC and Fast Pthr Probe LC protocols were satisfying. Furthermore, the melt curve analysis using Green 2x Master Mix without ROX the Fast PAH12 Green LC protocol confirmed high specificity.