Die qPCR / Real Time Quantitative PCR

Die Real Time PCR (Echtzeit-PCR), auch als quantitative oder qPCR bezeichnet, ist ein sehr effektives Mittel, um die Amplifikation von DNA in-vitro zu messen. Unter dem Begriff "Real Time" versteht man die gleichzeitige Amplifikation und den Nachweis, bzw. die Quantifizierung von Nukleinsäuren mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

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qPCR Reagenzien

Hierzu werden spezielle Real Time-Geräte benötigt, die gleichzeitig DNA amplifizieren und zur selben Zeit ein Fluoreszenzsignal detektieren können. Der zusätzliche, sehr zeitaufwendige und schwer zu quantifizierende Schritt der Gelelektrophorese ist dabei unnötig.

Bei der Real Time Quantitativen PCR werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Verfahren benutzt, die es ermöglichen, während der PCR die Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente zu detektieren und einen starken Anstieg im Fluoreszenzsignal während der Real Time Quantitativen PCR zu erhalten.

Um eine Messung sehr geringer DNA-Mengen zu ermöglichen, sollte das Fluoreszenzsignal zu Beginn der PCR so gering wie möglich und gleichzeitig sollte der Anstieg in der Fluoreszenz mit fortschreitender PCR so groß wie möglich sein. Heutzutage werden zwei prinzipielle Ansätze in der Real Time Quantitativen PCR benutzt, um die in-vitro Amplifikation von DNA direkt zu messen:

1. Einsatz einer mit einem Fluorophor gelabelten DNA-Sonde in der Real Time Quantitativen PCR
- Real Time Quantitative PCR mit TaqMan^® Probes, bestehend aus einem Fluorophor (Donor-Fluorochrom) an einem Ende des Primers und einem Quenchermolekül (Akzeptor-Fluorochrom) am anderen Ende des Primers. Der geringe Abstand zwischen Fluorophor und Quencher sorgt hierbei dafür, dass die Fluoreszenz vom Quencher inhibiert wird und nach außen hin nicht gemessen werden kann. Während der Real Time Quantitativen PCR wird die an den Einzelstrang gebundende Sonde durch die 3’-5’ Exonukleaseakitivität der Polymerase abgebaut, wodurch die räumliche Nähe zwischen Fluorophor und Quencher aufgehoben wird und der Quencher somit die Fluoreszenz des Fluorophors nicht mehr inhibieren kann. Je weiter nun die qPCR fortschreitet, desto mehr Fluoreszenzmoleküle werden freigesetzt und umso höher wird die messbare Fluoreszenz.

- Real Time Quantitative PCR mit Molecular Beacons (Probes mit einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül und einem Quencher an einer Sonde, die bei niedrigen Temperaturen eine Haarnadelstruktur ausbilden). Auch bei den Molecular Beacons ist das Fluorochrom am einen Ende des Primers und der Quencher am anderen Ende des Primers angebracht. Durch die Haarnadelstruktur sind beide Moleküle in unmittelbarer Nachbarschaft und der Energieübergang vom Fluorophor zum Quencher kann somit unmittelbar und direkt erfolgen. Im Verlauf der Real Time Quantitative PCR wird bei höheren Temperaturen (Denaturierung) die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört und beim anschließenden Abkühlen kann die Sonde dann an den spezifischen DNA-Bereich binden, dessen Sequenz komplementär ist. Sobald die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört wird, befinden sich Quencher und Fluorophor in großem Abstand, so dass die Fluoreszenz des Fluorophors detektierbar wird. Je mehr DNA amplifiziert wird, desto mehr Molecular Beacons können mit der amplifizierten DNA hybridisieren und desto höher wird das Fluoreszenzsignal.

Neben den Fluoreszenzsonden benötigt man für die Durchführung der Real Time Quantitativen PCR noch spezielle DNA-amplifizierende Enzyme. Diese werden in Form von vorgefertigten qPCR Mastermixen, die bis auf Primer und Template DNA alles für die qPCR enthalten, kommerziell angeboten. Von Genaxxon sind das folgende Produkte: M3010 (High ROX) - M3031 (Low ROX) - M3045 (No ROX). Um die Mastermixe auch ohne Kühlung stabil zu halten, wurden von Genaxxon lyophilisierte (gefriergetrocknete) Mastermixe entwickelt, die bei Umgebungstemperatur (10°C bis 35°C) mindestens 2 Jahre stabil sind.

2. Einsatz mit unspezifischem, interkalierendem Fluoreszenzfarbstoff in der Real Time Quantitativen PCR
Die oben beschriebenen Methoden sind sehr spezifisch und sensitiv, aber auch sehr teuer, da alle Sonden (spezifische Primer mit anhängendem Flurophor und Quencher) keine Niedrigpreisprodukte sind. Um Kosten zu sparen, kann man daher auch mit unspezifischen, interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen in der Real Time Quantitativen PCR arbeiten, die im nicht an DNA gebundenen Zustand eine sehr geringe Fluoreszenz zeigen, welche durch Bindung an DNA aber stark zunimmt. Entsprechende qPCR Mastermixe mit grünem Fluoreszenzfarbstoff werden kommerziell angeboten. Von Genaxxon sind das folgende Produkte:  M3011 (Low ROX) - M3023 (No ROX) - M3052 (High ROX). Durch die Bindung des grünen Fluoreszenzfarbstoffs an DNA kommt es zu Konformationsänderungen im Fluoroszenzfarbstoffmolekül, was einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz nach sich zieht, wobei die gemessene Fluoreszenz mit der vervielfältigten Menge an DNA korreliert.

Real Time PCR-Geräte können nun die Fluoreszenz bzw. den Anstieg der Fluoreszenz während der PCR-Reaktion messen und eine schnelle Quantifizierung mittels mathematischer Algorythmen durchführen, die eine genaue Bestimmung des Ct-Werts oder der Schmelztemperatur von doppelsträngiger DNA in der Real Time Quantitativen PCR erlauben.

Bei entsprechender Kalibrierung des Real Time PCR-Geräts kann dann direkt die Menge an DNA (RNA) bestimmt werden, die anfänglich in der Probe enthalten war.

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