03.03.15 Text zur Seite RealTime PCR:

 

RealTime PCR

Die RealTime PCR, auch bekannt als quantitative, oder qPCR, ist ein sehr effektives Mittel, um die Amplifikation von DNA in-vitro zu messen und die spezifischen Fragmente ohne Agarosegele sichtbar zu machen. Wie der Begriff "RealTime" schon aussagt, wird bei dieser Methode die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit gemessen. Hierzu werden spezielle RealTime PCR Geräte benötigt, die gleichzeitig DNA amplifizieren können und ein Fluoreszenzsignal detektieren. Der zusätzliche, sehr zeitaufwendige und schwierig zu quantifizierende Schritt der Gelelektrophorese  ist dabei unnötig.

Bei der RealTime PCR werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Verfahren heran gezogen, die es ermöglichen sollen, während der PCR die Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente zu detektieren/verfolgen und um einen starken Anstieg im Fluoreszenzsignal während der PCR zu erhalten.

Um die Möglichkeit zu haben den Anstieg der Fluoreszenz zu messen, muss ein Mechanismus zugrunde liegen, der einerseits garantiert, dass zum Beginn der PCR praktisch keine Fluoreszenzsignal vorhanden ist, der aber ebenfalls garantiert, dass mit zunehmender PCR die amplifizierte DNA zu einem entsprechenden Anstieg der Fluoreszenz führt.

Heutzutage werden zwei prinzipielle Ansätze benutzt um die in-vitro Amplifikation von DNA direkt zu messen:

Einsatz einer mit einem Fluorophor gelabelten DNA-Sonde
- TaqMan® Probes, bestehen aud einem Fluorophor (Donor-Fluorochrom) an einem Ende des Primers und einem Quenchermolekül (Akzeptor-Fluorochrom) am anderen Ende des Primers, wobei der geringe Abstand zwischen Fluorophor und Quencher dafür sorgt, dass die Fluoreszenz vom Quencher aufgenommen wird und nach außen hin nicht gemessen werden kann. Während der PCR wird die an die Einzelstrang gebundende Sonde durch die 3’-5’ Exonukleaseakitivität der Polymerase abgebaut wodurch die räumliche Nähe zwischen Fluorophor und Quencher aufgehoben wird und der Quencher somit die Fluorezenz des Fluorphors nicht mehr inhibieren kann. Je mehr nun die PCR fortschreitet, desto mehr Fluorezenzmoleküle werden frei gesetzt und umso höher wird die messbare Fluoreszenz.

- Molecular Beacons (Probes mit einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül und einem Quencher, an einer Sonde, die bei niedrigen Temperaturen eine Haarnadelstruktur ausbilden). Auch bei den Molecular Beacons ist das Fluorochom am einen Ende des Primers und der Quencher am anderen Ende des Primers angebracht. Durch die Haarnadelstruktur sind beide Moleküle in unmittelbarer Nachbarschaft und der Energieübergang vom Fluorophor zum Quencher kann somit unmittelbar und direkt erfolgen. Bei höheren Temperaturen (Denaturierung) wird die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört und beim anschließenden abkühlen kann die Sonde dann an den spezifischen DNA-Bereich binden, dessen Sequenz komplementär ist. Sobald die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört wird, befinden sich Quencher und Fluorophor in großem Abstand, so dass die Fluoreszenz des Fluorophores detektierbar wird. Je mehr DNA amplifiziert wird, desto mehr Molecular Beacons können mit der amplifizierten DNA hybridisieren und desto höher wird das Fluoreszenzsignal.

- Die oben beschriebenen Methoden sind sehr spezifisch und sensitiv, aber auch sehr teuer, da alle Probes (Primer mit anhängenden FLurophor und Quencher) keine Niedrigpreisprodukte sind. Um Kosten zu sparen, kann ma daher auch mit unspezifischen, interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen arbeiten, die im nicht an DNA-gebundenem Zustand eine sehr geringe Fluoreszenz zeigen, die aber durch Bindung an DNA stark zunimmt. Durch die Bindung an DNA kommt es zu Konformationsänderungen im Fluoroszenzfarbstoffmolekül was einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz nach sich zieht, wobei die gemessene Fluoreszenz mit der Vervielfältigung/Menge der DNA korreliert.

RealTime PCR Geräte können nun die Fluoreszenz, bzw. den Anstieg der Fluoreszenz während der PCR-Reaktion messen und eine schnelle Quantifizierung mittels mathematischer Algorythmen durchführen, die eine genaue Bestimmung des Ct-Werts oder der Schmelztemperatur von doppelsträngiger DNA erlauben.

Bei entsprechender Kalibration des RealTime PCR Geräts, kann somit direkt die Menge an DNA (RNA) bestimmt werden, die anfänglich in der Probe enthalten war.

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Die RealTime PCR, auch bekannt als quantitative, oder qPCR, ist ein sehr effektives Mittel, um die Amplifikation von DNA in-vitro zu messen und die spezifischen Fragmente ohne Agarosegele sichtbar zu machen. Wie der Begriff "RealTime" schon aussagt, wird bei dieser Methode die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit gemessen. Hierzu werden spezielle RealTime PCR Geräte benötigt, die gleichzeitig DNA amplifizieren können und ein Fluoreszenzsignal detektieren. Der zusätzliche, sehr zeitaufwendige und schwierig zu quantifizierende Schritt der Gelelektrophorese  ist dabei unnötig.

Bei der RealTime PCR werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Verfahren heran gezogen, die es ermöglichen sollen, während der PCR die Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente zu detektieren/verfolgen und um einen starken Anstieg im Fluoreszenzsignal während der PCR zu erhalten.

Um die Möglichkeit zu haben den Anstieg der Fluoreszenz zu messen, muss ein Mechanismus zugrunde liegen, der einerseits garantiert, dass zum Beginn der PCR praktisch keine Fluoreszenzsignal vorhanden ist, der aber ebenfalls garantiert, dass mit zunehmender PCR die amplifizierte DNA zu einem entsprechenden Anstieg der Fluoreszenz führt.

Heutzutage werden zwei prinzipielle Ansätze benutzt um die in-vitro Amplifikation von DNA direkt zu messen:

Einsatz einer mit einem Fluorophor gelabelten DNA-Sonde
- TaqMan® Probes, bestehen aud einem Fluorophor (Donor-Fluorochrom) an einem Ende des Primers und einem Quenchermolekül (Akzeptor-Fluorochrom) am anderen Ende des Primers, wobei der geringe Abstand zwischen Fluorophor und Quencher dafür sorgt, dass die Fluoreszenz vom Quencher aufgenommen wird und nach außen hin nicht gemessen werden kann. Während der PCR wird die an die Einzelstrang gebundende Sonde durch die 3’-5’ Exonukleaseakitivität der Polymerase abgebaut wodurch die räumliche Nähe zwischen Fluorophor und Quencher aufgehoben wird und der Quencher somit die Fluorezenz des Fluorphors nicht mehr inhibieren kann. Je mehr nun die PCR fortschreitet, desto mehr Fluorezenzmoleküle werden frei gesetzt und umso höher wird die messbare Fluoreszenz.

- Molecular Beacons (Probes mit einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül und einem Quencher, an einer Sonde, die bei niedrigen Temperaturen eine Haarnadelstruktur ausbilden). Auch bei den Molecular Beacons ist das Fluorochom am einen Ende des Primers und der Quencher am anderen Ende des Primers angebracht. Durch die Haarnadelstruktur sind beide Moleküle in unmittelbarer Nachbarschaft und der Energieübergang vom Fluorophor zum Quencher kann somit unmittelbar und direkt erfolgen. Bei höheren Temperaturen (Denaturierung) wird die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört und beim anschließenden abkühlen kann die Sonde dann an den spezifischen DNA-Bereich binden, dessen Sequenz komplementär ist. Sobald die Haarnadelstruktur der Sonde zerstört wird, befinden sich Quencher und Fluorophor in großem Abstand, so dass die Fluoreszenz des Fluorophores detektierbar wird. Je mehr DNA amplifiziert wird, desto mehr Molecular Beacons können mit der amplifizierten DNA hybridisieren und desto höher wird das Fluoreszenzsignal.

- Die oben beschriebenen Methoden sind sehr spezifisch und sensitiv, aber auch sehr teuer, da alle Probes (Primer mit anhängenden FLurophor und Quencher) keine Niedrigpreisprodukte sind. Um Kosten zu sparen, kann ma daher auch mit unspezifischen, interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen arbeiten, die im nicht an DNA-gebundenem Zustand eine sehr geringe Fluoreszenz zeigen, die aber durch Bindung an DNA stark zunimmt. Durch die Bindung an DNA kommt es zu Konformationsänderungen im Fluoroszenzfarbstoffmolekül was einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz nach sich zieht, wobei die gemessene Fluoreszenz mit der Vervielfältigung/Menge der DNA korreliert.

RealTime PCR Geräte können nun die Fluoreszenz, bzw. den Anstieg der Fluoreszenz während der PCR-Reaktion messen und eine schnelle Quantifizierung mittels mathematischer Algorythmen durchführen, die eine genaue Bestimmung des Ct-Werts oder der Schmelztemperatur von doppelsträngiger DNA erlauben.

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