Aminosäureanalyse mittels oxidativer Hydrolyse

Die Aminosäureanalyse mittels oxidativer Hydrolyse wird dann eingesetzt, wenn Cystein und Methionin in Proteinen oder Peptiden quantifiziert werden sollen, da sowohl Cystein als auch Methionin in Salzsäure einer Zersetzung aufgrund von Nebenreaktionen unterliegen. So oxidiert Methionin, bei der einfachen Totalhydrolyse in 6N HCl, unter partieller Oxidation zu Methioninsulfoxid, das in salzsaurer Lösung nicht stabil ist. Beide Aminosäuren müssen daher vor der Totalhydrolyse mit 6N HCl in säurestabile Derivate überführt werden. Dies geschied bei Genaxxon mittels Oxidation mit Perameisensäure. Die Perameisensäure oxidiert Cystein komplett zu Cysteinsäure bzw. Methionin komplett zu Methioninsulfon umgesetzt werden. Beide Verbindungen sind in salzsaurer Lösung stabil. Bei der Oxidation mit Perameisensäure können Cystein und Methionin in säurestabile Derivate überführt werden, die Oxidation zersört aber gleichzeitig Tyrosin komplett und Phenylalanin und Histidin zumindest teilweise.

Nach dem Oxidationsschritt mit Perameinsensäure kann die Analysenprobe dann der Totalhydrolyse mit 6N HCl zugeführt werden. Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat getrocknet, in Puffer aufgenommen und der Trennung der einzelnen Aminosäuren mittels HPLC zugeführt. Der Nachweis der Aminosäuren erfolgt bei Genaxxon mittels Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin. Das Ergebnis wird unseren Kunden mittels eines ausführlichen Ergebnisreports als pdf- und excel-file zur Verfügung gestellt.

Es werden reine Proben benötigt. Salze und Puffer oder Detergenzien wirken sich negativ aus. Primäre und sekundäre Amine würden mit den entstehenden Carbamaten reagieren und somit die Ergebnisse verfälschen, während Salze (besonders starke Puffer) den pH beeinflussen, was bis zu einem kompletten Misslingen der Hydrolyse oder der Derivatisierung führen kann. Zusätzlich sind größere Mengen an Glycerin oder Kohlenhydrate problematisch, da Glycerin nichtflüchtig und hygroskopisch ist und Kohlenhydrate verkohlen und die Aminosäuren an sich binden. Chitinhaltige Proben, Knochen, oder Knorpelmaterial wie auch Blutplasma lassen sich gut analysieren.

Für die Analyse von Proteinen werden 25µg bis 100µg (500pmol bis 2nmol) an Protein benötigt. Die genaue Menge hängt vom jeweiligen Molekulargewicht des Proteins ab. Für die Analyse von Peptiden reichen geringere Mengen aus. Es werden 5µg bis 20µg (5nmol bis 25nmol) benötigt. Die Proben können lyophilisiert oder in Lösung an Genaxxon verschickt werden.

Eine Totalhydrolyss mit 6N HCl (P2145.0001 >) ist notwendig, wenn es sich um die Analyse von gebundenen Aminosäuren (Proteinen, Peptide) handelt. Da Methionin und Cystein bei der Totalhydrolyse zerstört werden, bieten wir die oxidative Totalhydrolyse zur quantitativen Bestimmung dieser Aminosäuren an (P2145.0005 >). Für die Bestimmung freier Aminosäure wird keine Totalhydrolyse benötigt (P2145.0002 >).