DNA Klonierung & Ligation

Die DNA-Klonierung ist mittlerweile eine etablierte Methode, bei der DNA-Fragmente beliebiger Herkunft in einen Klonierungsvektor mit Hilfe von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen eingefügt werden. Die so entstandenen rekombinanten DNA-Moleküle werden daraufhin vor allem in Bakterienzellen, aber auch Viren und vereinzelt auch in eukaryotische Zellen eingeschleust (über Transfektion > und Transformation >). In den Wirtszellen kommt es zur Vervielfältigung der DNA-Moleküle. Es kommt somit zu einer beinahe unbegrenzten Menge an DNA. Diese DNA-Abschnitte werden daraufhin auf Fehlerfreiheit hin untersucht und in weiteren Prozessen, zum Beispiel bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen (Beispiel: IL-3 >, VEGF >), eingesetzt.

DNA-Ligasen katalysieren die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen den 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphat-Enden von benachbarten DNA-Resten. In lebenden Organismen spielen Ligasen eine entscheidende Rolle bei der DNA-Replikation und DNA-Reparatur. In vitro wird das Enzym dazu verwendet, doppelsträngige DNA-Fragmente mit glatten oder kohäsiven Enden zu verbinden, um zum Beispiel rekombinante DNA-Plasmide zu bilden oder DNA-Sonden für die SNP-Detektion zu verbinden.

Die T4 DNA-Ligase > kann sowohl blunt-end (glatte) als auch kohäsive (überlappende) DNA-Enden in doppelsträngiger DNA/RNA verbinden. Sie repariert Einzelstrangbrüche in Duplex-DNA, RNA und DNA/RNA-Hybriden.

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chemisch kompetente Zellen >- T4 DNA-Ligase für die Ligation >