ReproFast proofreading Polymerase



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ReproFast Polymerase verspricht eine optimale PCR, insbesondere kürzere Extensionzeiten, höhere... mehr
Produktinformationen "ReproFast proofreading Polymerase"

ReproFast Polymerase verspricht eine optimale PCR, insbesondere kürzere Extensionzeiten, höhere Ausbeuten und längere Amplikons im Vergleich zu Pwo und Pfu. Die Hauptapplikation für das Enzym liegt bei der Amplifikation von längeren Zielsequenzen, auch von genomischer DNA, zur anschließenden Klonierung, oder zur PCR kleiner Fragmente mit einem Standard Taq PCR Protokoll. Mit der ReproFast wird es möglich, auch DNA von bis zu 5 kb aus humaner genomischer DNA and bis zu 7 kb für Lambda DNA (Barnes (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91. 2216-2220) mit der Genauigkeit der Pfu- oder Pwo Polymerase zu amplifizieren. ReproFast DNA-Polymerase ist eine thermostabile hochprozessive 5' - 3' DNA Polymerase mit zusätzlicher 3' - 5' Exonukleaseaktivität (proof-reading = erzeugt keine A-Überhänge / einsetzbar für blunt-end Klonierung).

Einmaliges Testmuster zum Sonderpreis erhältlich. Keine Versandkosten bei Versand innerhalb Deutschlands! Der Testmusterpreis wird bei der ersten offiziellen Bestellung des Produkts zurückerstattet.

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- M3030 ExactRun (Phusion like) Proofreading Polymerase >

Mit unseren hochwertigen dNTPs als Set (M3015.4100 und M3015.0250) > oder als Mix (M3016.1010) > oder unseren DNA-Markern > und unserer günstigen Standardagarose > bieten wir Ihnen weitere Produkte für die PCR.

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Unser Kommentar zu "ReproFast proofreading Polymerase"
3' - 5' Exonuclease activity (proof-reading activity)
5 U/µL 3' - 5' Exonuclease activity (proof-reading activity) mehr
 

Technische Daten:

5 U/µL

3' - 5' Exonuclease activity (proof-reading activity)

Applikation:

Polymerase mixture to be used for long fragments in PCR

Einheitendefinition:

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C), 50 mM

Quelle

recombinant

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

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Für jedes Template / Primer-Paar müssen die optimalen Reaktionsbedingungen empirisch evaluiert werden, indem man z.B. Verhältnis von Primer zu Template ändert oder die Ionenstärke (mit MgSO4) sowie Zyklusparameter (Zeit und Temperaturen).

DNA Template

  • Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige DNA-Templates
  • Ungefähr 10E4 Kopien an Ziel-DNA werden benötigt, um nach 25-30 Zyklen ein detektierbares Produkt zu erhalten.
  • Benutzen Sie 1pg–1ng Plasmid-DNA oder virale DNA.
  • Benutzen Sie 1ng–1µg bei genomischer DNA.
  • Höhere DNA-Konzentrationen vermindern die Ampliconspezifität und ergeben z.B. Extrabanden, besonders wenn eine hohe Zyklenzahl eingesetzt wird.
  • Höhere DNA-Konzentrationen können eingesetzt werden, wenn kleinere Zyklenzahlen erwünscht sind, um z.B. die Spezifität zu erhöhen.

Primer

  • Generell sollten diese 20-30 Nukleotide in der Länge besitzen.
  • Der ideale GC-Gehalt liegt bei 40-60%.
  • Die GC-Basen sollten möglichst gleichmäßig über den/die Primer verteilt sein.
  • Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
  • Vermeiden Sie Sekundärstrukturen (z.B. Hairpins) innerhalb der Primer und der potentiellen Dimerisationsbereiche zwischen den verwendeten Primerpaaren.
  • Wenn gentechnisch veränderte Stellen (side directed mutagenesis) in die Primer eingebaut werden, dann ist es besser, wenn 5' von der side direkted mutagenesis Stelle noch 4-6 Extrabasen eingebaut werden, damit der Primer auch an der richtigen Stelle annealen kann.
  • Die Endkonzentration von jedem Primer sollte zwischen 0,05-1 µM liegen (0,05 µM ist die unterste Grenze), typische Werte liegen zwischen 0,1 und 0,5 µM. 
  • Höhere Konzentrationen können eine erhöhte Primerdimerisierung zur Folge haben und falsche Amplifikationsprodukte "generieren" bzw. vortäuschen.
  • Bei Primern und Sonden kann man davon ausgehen, dass mit zunehmender Primermenge natürlich zunächst auch die PCR besser läuft (meistens ist zunächst ein früherer Ct-Wert zu erwarten). Mit weiter zunehmender Konzentration ist die PCR aber gesättigt. Neben einem etwas niedrigeren Ct-Wert wird anfänglich bei höherer Primer/Sondenkonzentration meistens auch das Fluoreszenzsignal verstärkt.
  • Dazu kommen dann ggf. eine oder mehrere Sonden (hierbei sollte die notwendige Konzentration immer gut ausgetestet werden). Wir empfehlen zwischen 50-500 nM. In diesem Bereich sollten verschiedene Kombinationen ausgetestet werden.

Magnesiumkonzentration

  • 1,5-2,0 mM Mg2+ sind optimal für die Wirkung der Taq DNA Polymerase, jedoch hängt die optimale Mg2+ Konzentration sehr stark vom Template, der Pufferzusammensetzung, der Menge an DNA und auch an dNTPs ab, da vor allem die beiden letzteren eine hohe Tendenz haben, Magnesium zu chelatieren und damit der PCR-Reaktion zu entziehen.
  • Wenn [Mg2+] zu niedrig ist: Kein PCR-Produkt sichtbar.
  • Wenn [Mg2+] zu hoch ist: unerwünschte/falsche PCR-Produkte sind sichtbar. Eventuell ist nur noch ein Schmier zu sehen.

 Deoxynukleotide (dNTPs >)

  • Die typische Konzentration beträgt 200 µM von jedem einzelnen dNTP. Grundsätzlich sind 200-400 µM an dNTPs aber eine gute Konzentration für die PCR.
  • Eine niedrigere Konzentration von 50-100 µM erhöht die Spezifität, reduziert aber die Ausbeute zum Teil deutlich.
  • Eine höhere Konzentration erhöht zwar die Ausbeute besonders bei langen Amplicons, reduziert aber die Spezifität deutlich.

DNA-Polymerase

  • Die Wahl der richigen Polymerase ist u.a. abhängig vom Verwendungszweck sowie vom eingesetzten Template (Standard-PCR: Taq DNA Polymerase S > mit hoher Genauigkeit, Taq Polymerase E > mit hoher Ausbeute; Mastermixe: Standard PCR Mastermix > oder RedMasterMix > mit rotem Farbstoff).
  • Für die Multiplex PCR gibt es spezielle lyophilisierte Multiplex Mastermixe >.
  • Zur Steigerung der Spezifität oder bei schwierigen Templates werden Hot Start Anwendungen empfohlen. Hierfür gibt es spezielle Hot Start Polymerasen >.
  • Für PCRs für Klonierungen oder andere Verfahren, die eine geringe Fehlerquote erfordern, gibt es thermostabile High Fidelity Proofreading Polymerasen wie
    Pfunds >ExactRun >, ReproFast > oder ReproHot (KOD) Proofreading Polymerase >. Diese Enzyme machen weit weniger Fehler während der Amplifikation und erhöhen die Chancen auf ein fehlerfreies Amplicon.
  • Für Genotypisierungen und andere Anwendungen, bei denen eine hohe Unterscheidungsrate (high discrimination) benötigt wird, gibt es eine neue hochselektive DNA Polymerase, SNP Pol DNA Polymerase >. Sie unterscheidet fehlgepaarte Primer-Template Komplexe spezifisch und liefert gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren.
  • Für die Real Time Quantitative PCR > gibt es hochspezialisierte qPCR Mastermixe. Hier kommt es bei der Wahl des richtigen Mastermixes auf das verwendete qPCR-Gerät an. So ist darauf zu achten, ob und wieviel ROX im qPCR Mastermix enthalten sein sollte und ob es eher ein Green qPCR Mastermix mit grünem Fluoreszenzfarbstoff > oder ein Probe qPCR Mastermix > ohne Fluoreszenzfarbstoff sein muss. Diesen gibt es auch lyophilisiert bei Raumtemperatur stabil in Beads (LyoBalls >).
  • Die Menge an eingesetzter DNA-Polymerase in der PCR-Reaktion kann das PCR-Ergebnis signifikant beeinflussen (verwenden Sie 1,25 - 1,5 units Taq-Polymerase > für einen 50µL-Ansatz).

 Allgemeine Richtlinien

  • Annealing
  • Die Annealingtemperatur sollte mit einem Temperaturgradienten optimiert werden. Auch die Annealingzeit hat einen Einfluss auf das Gelingen. Es gilt, dass der Einsatz eines anderen Mastermixes oder der Einsatz eines Reaktionspuffers eines anderen Anbieters einen gravierenden Einfluß auf die Annealingtemperatur haben kann.
  • Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
  • Typische Annealingtemperaturen liegen ca. 5°C unterhalb des niedrigsten Tm der eingesetzten Primer. Oft fallen die Temperaturen in den Bereich von 50-60°C.
  • Höhere Annealingtemperaturen sollten getestet werden, wenn es zu unspezifischen Banden oder einem Schmier kommt.
  • Typsiche Annealingzeiten liegen im Bereich von 15-30 Sekunden.

Extensionstemperatur und -zeiten

  • Die Amplicon-Verlängerung wird normalerweise bei 68°C durchgeführt.
  • Als allgemeine Regel kann man pro 1000 Basenpaaren von 1 Minute Extensionszeit bei 68°C ausgehen (oder 2 Minuten für 2000 Basenpaare, bzw. 3 Minuten für 3000 Basenpaare). 
  • Für PCR-Produkte, die kleiner als 1 kb sind, können 45-60 Sekunden genommen werden (eher 45 Sekunden, wenn es sich nicht um ein Amplicon nahe 1 kb handelt).
  • Sowohl bei PCR-Produkten, die länger als 3000 Basenpaare sind, als auch bei PCR-Protokollen, die mehr als 30 Zyklen haben, ist es wahrscheinlich, dass längere Extenstionszeiten benötigt werden. Daher sollte bei längeren Amplicons oder bei höheren Zyklenzahlen nochmals optimiert werden.

Die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt, starken Sekundärstrukturen, niedrigen Konzentrationen oder Amplicons größer 5 kb benötigen sehr oft eine Optimierung der PCR-Bedingungen. Typischerweise sollten 15-30 Sekunden Denaturierung bei 95°C während der PCR durchgeführt werden.

 
 
 
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Referenzen..

Hier finden Sie Artikel und Literaturzitate, in denen die Autoren auf die hohe Qualität dieses Genaxxonprodukts vertrauen.
Listed below are articles and references, in which the authors trust in the high quality of this Genaxxon product.

Quelle/Source: NCBI PubMed >

 

Industrial Acetogenic Biocatalysts: A Comparative Metabolic and Genomic Analysis

 

Frank R. Bengelsdorf, Anja Poehlein, Sonja Linder, Catarina Erz, Tim Hummel, Sabrina Hoffmeister, Rolf Daniel, Peter Dürre

 

Front Microbiol. 2016; 7: 1036.  Published online 2016 Jul 7. doi: 10.3389/fmicb.2016.01036

 

PMCID: PMC4935695

 

 

 

A Putative Non-Canonical Ras-Like GTPase from P. falciparum: Chemical Properties and Characterization of the Protein

 

Annette Kaiser, Barbara Langer, Jude Przyborski, David Kersting, Mirko Krüger

 

PLoS One. 2015; 10(11): e0140994.  Published online 2015 Nov 5. doi: 10.1371/journal.pone.0140994

 

PMCID: PMC4634863

 

 

 

Functionally redundant but dissimilar microbial communities within biogas reactors treating maize silage in co-fermentation with sugar beet silage

 

Susanne G Langer, Sharif Ahmed, Daniel Einfalt, Frank R Bengelsdorf, Marian Kazda

 

Microb Biotechnol. 2015 Sep; 8(5): 828–836.  Published online 2015 Jul 22. doi: 10.1111/1751-7915.12308

 

PMCID: PMC4554470

 

 

 

Analysis of the key enzymes of butyric and acetic acid fermentation in biogas reactors

 

Christina Gabris, Frank R Bengelsdorf, Peter Dürre

 

Microb Biotechnol. 2015 Sep; 8(5): 865–873.  Published online 2015 Jun 18. doi: 10.1111/1751-7915.12299

 

PMCID: PMC4554474

 

 

 

Genetic transformation of Knufia petricola A95 - a model organism for biofilm-material interactions

 

Steffi Noack-Schönmann, Tanja Bus, Ronald Banasiak, Nicole Knabe, William J Broughton, H Den Dulk-Ras, Paul JJ Hooykaas, Anna A Gorbushina

 

AMB Express. 2014; 4: 80.  Published online 2014 Nov 4. doi: 10.1186/s13568-014-0080-5

 

PMCID: PMC4230810

 

 

 

A Set of Engineered Escherichia coli Expression Strains for Selective Isotope and Reactivity Labeling of Amino Acid Side Chains and Flavin Cofactors

 

Jennifer Mehlhorn, Helena Steinocher, Sebastian Beck, John T. M. Kennis, Peter Hegemann, Tilo Mathes

 

PLoS One. 2013; 8(11): e79006.  Published online 2013 Nov 1. doi: 10.1371/journal.pone.0079006

 

PMCID: PMC3815312

 

 

 

Liver hyperplasia after tamoxifen induction of Myc in a transgenic medaka model

 

Luciana A. Menescal, Cornelia Schmidt, Daniel Liedtke, Manfred Schartl

 

Dis Model Mech. 2012 Jul; 5(4): 492–502.  Published online 2012 Mar 15. doi: 10.1242/dmm.008730

 

PMCID: PMC3380712

 

 

 

Gene Cluster Involved in the Biosynthesis of Griseobactin, a Catechol-Peptide Siderophore of Streptomyces sp. ATCC 700974

 

Silke I. Patzer, Volkmar Braun

 

J Bacteriol. 2010 Jan; 192(2): 426–435.  Published online 2009 Nov 13. doi: 10.1128/JB.01250-09

 

PMCID: PMC2805312

 

 

 

Replacement of a Phenylalanine by a Tyrosine in the Active Site Confers Fructose-6-phosphate Aldolase Activity to the Transaldolase of Escherichia coli and Human Origin

 

Sarah Schneider, Tatyana Sandalova, Gunter Schneider, Georg A. Sprenger, Anne K. Samland

 

J Biol Chem. 2008 Oct 31; 283(44): 30064–30072.  doi: 10.1074/jbc.M803184200

 

PMCID: PMC2662071

 

 
 
 
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