Taq DNA-Polymerase E (Hohe Ausbeute)

Technische Daten:

Product Specifications
Concentration: 5 units/µL
Substrate analogs: dNTP, ddNTP, fluorescent dNTP/ddNTP
Extension rate: 2-4 kb/min. at 72°C
Half-life: 20min. at 95°C, 60min. at 94°C
5’-3’ exonuclease activity: Yes
Extra addition of A: Yes
3’-5’ exonuclease activity: No
Nuclease contamination: No
Protease contamination: No
RNase contamination: No
Self-priming activity: No

Applikation:

DNA polymerase to be used for standard PCR applications.

Einheitendefinition:

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C), 50 mM

Quelle

Thermus aquaticus strain

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Für jedes Template / Primer-Paar müssen die optimalen Reaktionsbedingungen empirisch evaluiert werden, indem man z.B. Verhältnis von Primer zu Template ändert oder die Ionenstärke (mit MgSO4) sowie Zyklusparameter (Zeit und Temperaturen).

DNA Template

• Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige DNA-Templates
• Ungefähr 10E⁴ Kopien an Ziel-DNA werden benötigt, um nach 25-30 Zyklen ein detektierbares Produkt zu erhalten.
• Benutzen Sie 1pg–1ng Plasmid-DNA oder virale DNA.
• Benutzen Sie 1ng–1µg bei genomischer DNA.
• Höhere DNA-Konzentrationen vermindern die Ampliconspezifität und ergeben z.B. Extrabanden, besonders wenn eine hohe Zyklenzahl eingesetzt wird.
• Höhere DNA-Konzentrationen können eingesetzt werden, wenn kleinere Zyklenzahlen erwünscht sind, um z.B. die Spezifität zu erhöhen.

Primer

• Generell sollten diese 20-30 Nukleotide in der Länge besitzen.
• Der ideale GC-Gehalt liegt bei 40-60%.
• Die GC-Basen sollten möglichst gleichmäßig über den/die Primer verteilt sein.
• Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
• Vermeiden Sie Sekundärstrukturen (z.B. Hairpins) innerhalb der Primer und der potentiellen Dimerisationsbereiche zwischen den verwendeten Primerpaaren.
• Wenn gentechnisch veränderte Stellen (side directed mutagenesis) in die Primer eingebaut werden, dann ist es besser, wenn 5' von der side direkted mutagenesis Stelle noch 4-6 Extrabasen eingebaut werden, damit der Primer auch an der richtigen Stelle annealen kann.
• Die Endkonzentration von jedem Primer sollte zwischen 0,05-1 µM liegen (0,05 µM ist die unterste Grenze), typische Werte liegen zwischen 0,1 und 0,5 µM.
• Höhere Konzentrationen können eine erhöhte Primerdimerisierung zur Folge haben und falsche Amplifikationsprodukte "generieren" bzw. vortäuschen.
• Bei Primern und Sonden kann man davon ausgehen, dass mit zunehmender Primermenge natürlich zunächst auch die PCR besser läuft (meistens ist zunächst ein früherer Ct-Wert zu erwarten). Mit weiter zunehmender Konzentration ist die PCR aber gesättigt. Neben einem etwas niedrigeren Ct-Wert wird anfänglich bei höherer Primer/Sondenkonzentration meistens auch das Fluoreszenzsignal verstärkt.

• Dazu kommen dann ggf. eine oder mehrere Sonden (hierbei sollte die notwendige Konzentration immer gut ausgetestet werden). Wir empfehlen zwischen 50-500 nM. In diesem Bereich sollten verschiedene Kombinationen ausgetestet werden.

Magnesiumkonzentration

• 1,5-2,0 mM Mg2+ sind optimal für die Wirkung der Taq DNA Polymerase, jedoch hängt die optimale Mg2+ Konzentration sehr stark vom Template, der Pufferzusammensetzung, der Menge an DNA und auch an dNTPs ab, da vor allem die beiden letzteren eine hohe Tendenz haben, Magnesium zu chelatieren und damit der PCR-Reaktion zu entziehen.
• Wenn [Mg2+] zu niedrig ist: Kein PCR-Produkt sichtbar.
• Wenn [Mg2+] zu hoch ist: unerwünschte/falsche PCR-Produkte sind sichtbar. Eventuell ist nur noch ein Schmier zu sehen.

Deoxynukleotide (dNTPs >)

• Die typische Konzentration beträgt 200 µM von jedem einzelnen dNTP. Grundsätzlich sind 200-400 µM an dNTPs aber eine gute Konzentration für die PCR.
• Eine niedrigere Konzentration von 50-100 µM erhöht die Spezifität, reduziert aber die Ausbeute zum Teil deutlich.
• Eine höhere Konzentration erhöht zwar die Ausbeute besonders bei langen Amplicons, reduziert aber die Spezifität deutlich.

DNA-Polymerase

• Die Wahl der richigen Polymerase ist u.a. abhängig vom Verwendungszweck sowie vom eingesetzten Template (Standard-PCR: Taq DNA Polymerase S > mit hoher Genauigkeit, Taq Polymerase E > mit hoher Ausbeute; Mastermixe: Standard PCR Mastermix > oder RedMasterMix > mit rotem Farbstoff).
• Für die Multiplex PCR gibt es spezielle lyophilisierte Multiplex Mastermixe >.
• Zur Steigerung der Spezifität oder bei schwierigen Templates werden Hot Start Anwendungen empfohlen. Hierfür gibt es spezielle Hot Start Polymerasen >.
• Für PCRs für Klonierungen oder andere Verfahren, die eine geringe Fehlerquote erfordern, gibt es thermostabile High Fidelity Proofreading Polymerasen wie
  Pfunds >, ExactRun >, ReproFast > oder ReproHot (KOD) Proofreading Polymerase >. Diese Enzyme machen weit weniger Fehler während der Amplifikation und erhöhen die Chancen auf ein fehlerfreies Amplicon.
• Für Genotypisierungen und andere Anwendungen, bei denen eine hohe Unterscheidungsrate (high discrimination) benötigt wird, gibt es eine neue hochselektive DNA Polymerase, SNP Pol DNA Polymerase >. Sie unterscheidet fehlgepaarte Primer-Template Komplexe spezifisch und liefert gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren.
• Für die Real Time Quantitative PCR > gibt es hochspezialisierte qPCR Mastermixe. Hier kommt es bei der Wahl des richtigen Mastermixes auf das verwendete qPCR-Gerät an. So ist darauf zu achten, ob und wieviel ROX im qPCR Mastermix enthalten sein sollte und ob es eher ein Green qPCR Mastermix mit grünem Fluoreszenzfarbstoff > oder ein Probe qPCR Mastermix > ohne Fluoreszenzfarbstoff sein muss. Diesen gibt es auch lyophilisiert bei Raumtemperatur stabil in Beads (LyoBalls >).
• Die Menge an eingesetzter DNA-Polymerase in der PCR-Reaktion kann das PCR-Ergebnis signifikant beeinflussen (verwenden Sie 1,25 - 1,5 units Taq-Polymerase > für einen 50µL-Ansatz).

Annealing

• Die Annealingtemperatur sollte mit einem Temperaturgradienten optimiert werden. Auch die Annealingzeit hat einen Einfluss auf das Gelingen. Es gilt, dass der Einsatz eines anderen Mastermixes oder der Einsatz eines Reaktionspuffers eines anderen Anbieters einen gravierenden Einfluß auf die Annealingtemperatur haben kann.
• Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
• Typische Annealingtemperaturen liegen ca. 5°C unterhalb des niedrigsten Tm der eingesetzten Primer. Oft fallen die Temperaturen in den Bereich von 50-60°C.
• Höhere Annealingtemperaturen sollten getestet werden, wenn es zu unspezifischen Banden oder einem Schmier kommt.
• Typsiche Annealingzeiten liegen im Bereich von 15-30 Sekunden.

Extensionstemperatur und -zeiten

• Die Amplicon-Verlängerung wird normalerweise bei 68°C durchgeführt.
• Als allgemeine Regel kann man bei Standard Taq-Polymerasen pro 1000 Basenpaaren von 1 Minute Extensionszeit bei 68°C ausgehen (oder 2 Minuten für 2000 Basenpaare, bzw. 3 Minuten für 3000 Basenpaare).
• Für PCR-Produkte, die kleiner als 1 kb sind, können 45-60 Sekunden genommen werden (eher 45 Sekunden, wenn es sich nicht um ein Amplicon nahe 1 kb handelt).
• Sowohl bei PCR-Produkten, die länger als 3000 Basenpaare sind, als auch bei PCR-Protokollen, die mehr als 30 Zyklen haben, ist es wahrscheinlich, dass längere Extenstionszeiten benötigt werden. Daher sollte bei längeren Amplicons oder bei höheren Zyklenzahlen nochmals optimiert werden.

Die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt, starken Sekundärstrukturen, niedrigen Konzentrationen oder Amplicons größer 5 kb benötigen sehr oft eine Optimierung der PCR-Bedingungen. Typischerweise sollten 15-30 Sekunden Denaturierung bei 95°C während der PCR durchgeführt werden.

Hier finden Sie Artikel und Literaturzitate, in denen die Autoren auf die hohe Qualität dieses Genaxxonprodukts vertrauen.
Listed below are articles and references, in which the authors trust in the high quality of this Genaxxon product.

Quelle/Source: NCBI PubMed >

Identification, Genotyping and Antimicrobial Susceptibility Testing of Brucella spp. Isolated from Livestock in Egypt
Aman Ullah Khan, Waleed S. Shell, Falk Melzer, Ashraf E. Sayour, Eman Shawkat Ramadan, Mandy C. Elschner, Amira A. Moawad, Uwe Roesler, Heinrich Neubauer, Hosny El-Adawy
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Metabolic Engineering of Escherichia coli for para-Amino-Phenylethanol and para-Amino-Phenylacetic Acid Biosynthesis
Behrouz Mohammadi Nargesi, Georg A. Sprenger, Jung-Won Youn
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Genome-wide polyadenylation site mapping datasets in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae
Marco Marconi, Ane Sesma, Julio Luis Rodríguez-Romero, María Lourdes Rosano González, Mark D. Wilkinson
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Blasticidin-S deaminase, a new selection marker for genetic transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum
Jochen M. Buck, Carolina Río Bártulos, Ansgar Gruber, Peter G. Kroth
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Deciphering the Adaptation of Corynebacterium glutamicum in Transition from Aerobiosis via Microaerobiosis to Anaerobiosis

Julian Lange, Eugenia Münch, Jan Müller, Tobias Busche, Jörn Kalinowski, Ralf Takors, Bastian Blombach
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Identification, differentiation and antibiotic susceptibility of Gallibacterium isolates from diseased poultry

Hosny El-Adawy, Herbert Bocklisch, Heinrich Neubauer, Hafez Mohamed Hafez, Helmut Hotzel
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An application of competitive reporter monitored amplification (CMA) for rapid detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs)

Juliane Havlicek, Eric Rivera-Milla, Peter Slickers, Sönke Andres, Silke Feuerriegel, Stefan Niemann, Matthias Merker, Ines Labugger
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The Conjugative Relaxase TrwC Promotes Integration of Foreign DNA in the Human Genome

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Genetic alterations in seborrheic keratoses

Barbara Heidenreich, Evygenia Denisova, Sivaramakrishna Rachakonda, Onofre Sanmartin, Timo Dereani, Ismail Hosen, Eduardo Nagore, Rajiv Kumar
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Post-translational Serine/Threonine Phosphorylation and Lysine Acetylation: A Novel Regulatory Aspect of the Global Nitrogen Response Regulator GlnR in S. coelicolor M145

Rafat Amin, Mirita Franz-Wachtel, Yvonne Tiffert, Martin Heberer, Mohamed Meky, Yousra Ahmed, Arne Matthews, Sergii Krysenko, Marco Jakobi, Markus Hinder, Jane Moore, Nicole Okoniewski, Boris Maček, Wolfgang Wohlleben, Agnieszka Bera
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Quantification of Slackia and Eggerthella spp. in Human Feces and Adhesion of Representatives Strains to Caco-2 Cells

Gyu-Sung Cho, Felix Ritzmann, Marie Eckstein, Melanie Huch, Karlis Briviba, Diana Behsnilian, Horst Neve, Charles M. A. P. Franz
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Transcriptional Regulation of the β-Type Carbonic Anhydrase Gene bca by RamA in Corynebacterium glutamicum

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Mapping of deletion breakpoints at the CDKN2A locus in melanoma: detection of MTAP-ANRIL fusion transcripts

Huaping Xie, P. Sivaramakrishna Rachakonda, Barbara Heidenreich, Eduardo Nagore, Antje Sucker, Kari Hemminki, Dirk Schadendorf, Rajiv Kumar
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DNase-Sensitive and -Resistant Modes of Biofilm Formation by Listeria monocytogenes

Marion Zetzmann, Mira Okshevsky, Jasmin Endres, Anne Sedlag, Nelly Caccia, Marc Auchter, Mark S. Waidmann, Mickaël Desvaux, Rikke L. Meyer, Christian U. Riedel
Front Microbiol. 2015; 6: 1428.  Published online 2015 Dec 22. doi: 10.3389/fmicb.2015.01428
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Skin-Derived C-Terminal Filaggrin-2 Fragments Are Pseudomonas aeruginosa-Directed Antimicrobials Targeting Bacterial Replication

Britta Hansmann, Jens-Michael Schröder, Ulrich Gerstel
PLoS Pathog. 2015 Sep; 11(9): e1005159.  Published online 2015 Sep 15. doi: 10.1371/journal.ppat.1005159
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Tight Junction Protein 1a regulates pigment cell organisation during zebrafish colour patterning

Andrey Fadeev, Jana Krauss, Hans Georg Frohnhöfer, Uwe Irion, Christiane Nüsslein-Volhard
eLife. 2015; 4: e06545.  Published online 2015 Apr 27. doi: 10.7554/eLife.06545Includes additional comments & authors
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Down-Regulation of ZmEXPB6 (Zea mays β-Expansin 6) Protein Is Correlated with Salt-mediated Growth Reduction in the Leaves of Z. mays L.

Christoph-Martin Geilfus, Dietrich Ober, Lutz A. Eichacker, Karl Hermann Mühling, Christian Zörb
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Phylogeny and Differentiation of Reptilian and Amphibian Ranaviruses Detected in Europe

Anke C. Stöhr, Alberto López-Bueno, Silvia Blahak, Maria F. Caeiro, Gonçalo M. Rosa, António Pedro Alves de Matos, An Martel, Alí Alejo, Rachel E. Marschang
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The Staphylococcus aureus NuoL-Like Protein MpsA Contributes to the Generation of Membrane Potential

Sonja Mayer, Wojtek Steffen, Julia Steuber, Friedrich Götz
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Transcriptional landscape and essential genes of Neisseria gonorrhoeae

Christian W. Remmele, Yibo Xian, Marco Albrecht, Michaela Faulstich, Martin Fraunholz, Elisabeth Heinrichs, Marcus T. Dittrich, Tobias Müller, Richard Reinhardt, Thomas Rudel
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Molecular evidence for convergent evolution and allopolyploid speciation within the Physcomitrium-Physcomitrella species complex

Anna K Beike, Mark von Stackelberg, Mareike Schallenberg-Rüdinger, Sebastian T Hanke, Marie Follo, Dietmar Quandt, Stuart F McDaniel, Ralf Reski, Benito C Tan, Stefan A Rensing
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Improvement of L-phenylalanine production from glycerol by recombinant Escherichia coli strains: The role of extra copies of glpK, glpX, and tktA genes

Katrin Gottlieb, Christoph Albermann, Georg A Sprenger
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Molecular Typing of MRSA and of Clinical Staphylococcus aureus Isolates from Iaşi, Romania

Stefan Monecke, Elke Müller, Olivia Simona Dorneanu, Teodora Vremeră, Ralf Ehrich
PLoS One. 2014; 9(5): e97833.  Published online 2014 May 20. doi: 10.1371/journal.pone.0097833
PMCID: PMC4028265

Bioelectric Signaling Regulates Size in Zebrafish Fins

Simon Perathoner, Jacob M. Daane, Ulrike Henrion, Guiscard Seebohm, Charles W. Higdon, Stephen L. Johnson, Christiane Nüsslein-Volhard, Matthew P. Harris
PLoS Genet. 2014 Jan; 10(1): e1004080.  Published online 2014 Jan 16. doi: 10.1371/journal.pgen.1004080
PMCID: PMC3894163

The PHOTOSYNTHESIS AFFECTED MUTANT68–LIKE Protein Evolved from a PSII Assembly Factor to Mediate Assembly of the Chloroplast NAD(P)H Dehydrogenase Complex in Arabidopsis

Ute Armbruster, Thilo Rühle, Renate Kreller, Christoph Strotbek, Jessica Zühlke, Luca Tadini, Thomas Blunder, Alexander P. Hertle, Yafei Qi, Birgit Rengstl, Jörg Nickelsen, Wolfgang Frank, Dario Leister
Plant Cell. 2013 Oct; 25(10): 3926–3943.  Published online 2013 Oct 4. doi: 10.1105/tpc.113.114785
PMCID: PMC3877787

Variants at the 9p21 locus and melanoma risk

Livia Maccioni, Panduranga Sivaramakrishna Rachakonda, Justo Lorenzo Bermejo, Dolores Planelles, Celia Requena, Kari Hemminki, Eduardo Nagore, Rajiv Kumar
BMC Cancer. 2013; 13: 325.  Published online 2013 Jul 2. doi: 10.1186/1471-2407-13-325
PMCID: PMC3702420

Phylogenetic and Molecular Analysis of Food-Borne Shiga Toxin-Producing Escherichia coli

Elisabeth Hauser, Alexander Mellmann, Torsten Semmler, Helen Stoeber, Lothar H. Wieler, Helge Karch, Nikole Kuebler, Angelika Fruth, Dag Harmsen, Thomas Weniger, Erhard Tietze, Herbert Schmidt
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German Francisella tularensis isolates from European brown hares (Lepus europaeus) reveal genetic and phenotypic diversity

Wolfgang Müller, Helmut Hotzel, Peter Otto, Axel Karger, Barbara Bettin, Herbert Bocklisch, Silke Braune, Ulrich Eskens, Stefan Hörmansdorfer, Regina Konrad, Anne Nesseler, Martin Peters, Martin Runge, Gernot Schmoock, Bernd-Andreas Schwarz, Reinhard Sting, Kerstin Myrtennäs, Edvin Karlsson, Mats Forsman, Herbert Tomaso
BMC Microbiol. 2013; 13: 61.  Published online 2013 Mar 21. doi: 10.1186/1471-2180-13-61
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Increased detection rates of EGFR and KRAS mutations in NSCLC specimens with low tumour cell content by 454 deep sequencing

Evgeny A. Moskalev, Robert Stöhr, Ralf Rieker, Simone Hebele, Florian Fuchs, Horia Sirbu, Sergey E. Mastitsky, Carsten Boltze, Helmut König, Abbas Agaimy, Arndt Hartmann, Florian Haller
Virchows Arch. 2013 Apr; 462(4): 409–419.  Published online 2013 Mar 7. doi: 10.1007/s00428-013-1376-6
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An efficient method for genome-wide polyadenylation site mapping and RNA quantification

Stefan Wilkening, Vicent Pelechano, Aino I. Järvelin, Manu M. Tekkedil, Simon Anders, Vladimir Benes, Lars M. Steinmetz
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Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum

Christopher F. Schuster, Jung-Ho Park, Marcel Prax, Alexander Herbig, Kay Nieselt, Ralf Rosenstein, Masayori Inouye, Ralph Bertram
J Bacteriol. 2013 Jan; 195(1): 115–125.  doi: 10.1128/JB.00400-12
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Detection of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Type XI Carrying Highly Divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr Genes in Human Clinical Isolates of Clonal Complex 130 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

Anna C. Shore, Emily C. Deasy, Peter Slickers, Grainne Brennan, Brian O'Connell, Stefan Monecke, Ralf Ehricht, David C. Coleman
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Quantitative Trait Loci Involved in Sex Determination and Body Growth in the Gilthead Sea Bream (Sparus aurata L.) through Targeted Genome Scan

Dimitrios Loukovitis, Elena Sarropoulou, Costas S. Tsigenopoulos, Costas Batargias, Antonios Magoulas, Apostolos P. Apostolidis, Dimitrios Chatziplis, Georgios Kotoulas
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The Apparent Malate Synthase Activity of Rhodobacter sphaeroides Is Due to Two Paralogous Enzymes, (3S)-Malyl-Coenzyme A (CoA)/β-Methylmalyl-CoA Lyase and (3S)- Malyl-CoA Thioesterase

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Sexual Reproduction as the Cause of Heat Resistance in the Food Spoilage Fungus Byssochlamys spectabilis (Anamorph Paecilomyces variotii)

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Nuclear Factor I X Deficiency Causes Brain Malformation and Severe Skeletal Defects

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Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution

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