Red MasterMix (2x) Taq PCR MasterMix mit rotem Farbstoff



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PCR MasterMix mit rotem Farbstoff für die visuelle Kontrolle der Pipettierschritt e: Nach der... mehr
Produktinformationen "Red MasterMix (2x) Taq PCR MasterMix mit rotem Farbstoff"

PCR MasterMix mit rotem Farbstoff für die visuelle Kontrolle der Pipettierschritte: Nach der PCR kann die Elektrophorese ohne Zugabe von Ladepuffer gefahren werden. Dadurch ist dieser PCR MasterMix (2x) zeit- und kostensparend. Der PCR Red MasterMix (2x) mit rotem Farbstoff zeichnet sich zudem durch eine hohe Spezifität für beste Ergebnisse aus. Der PCR MasterMix (2x) ist eine fertige Mischung (ready-to-use) aus:

- Taq DNA Polymerase
- dNTPs
- MgCl2
- rotem Farbstoff
- Reaktionspuffer 

in einer optimalen Konzentration für die effiziente Amplifikation von DNA Templates mittels PCR. Es müssen nur noch die Primer und die Template DNA dazu gegeben werden. Gleichzeitig enthält der PCR Mastermix noch einen Zusatz und einen roten Farbstoff, der es ermöglicht, eine anschließende Elektrophorese ohne Zugabe von Ladepuffer zu fahren. Dieser PCR RedMastermix wurde für die Verwendung in der Routine PCR bis 4 kb Amplikonlänge entwickelt. Die spezielle Zusammensetzung des Puffers garantiert reproduzierbare Ergebnisse selbst nach wiederholten Auftau- und Einfrierzyklen. Der PCR Mastermix mit rotem Farbstoff wird in praktischen Aliquots von 1,25mL verschickt.

Einmaliges Testmuster zum Sonderpreis erhältlich! Keine Versandkosten bei Versand innerhalb Deutschlands! Der Testmusterpreis wird bei der ersten offiziellen Bestellung des Produkts zurückerstattet.

Lesen Sie jetzt in unserem Blogbeitrag, wie Genaxxons Red MasterMix auch Ihnen Ihre Laborarbeit vereinfachen kann.

Unsere Agarosen > und DNA Marker > sind ideal für die nachfolgende Elektrophorese geeignet.

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Unser Kommentar zu "Red MasterMix (2x) Taq PCR MasterMix mit rotem Farbstoff"
fast, sensitive, convenient
Specifications: 2-time ready-to-use master mix for PCR including a red dye for better... mehr
 

Technische Daten:

Specifications:
2-time ready-to-use master mix for PCR including a red dye for better visualization of pipetting and as gel loading dye. dNTPs, buffer and DNA polymerase already included.

Convenient Aliquot size: 1.25mL. This master mix is stable for at least 8 months at +2°C to +8°C.

Applikation:

for reliable PCR from mouse tails.

Einheitendefinition:

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.

Quelle

synthetic

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

eclass-Nr: 32-16-05-02
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Für jedes Template / Primer-Paar müssen die optimalen Reaktionsbedingungen empirisch evaluiert werden, indem man z.B. Verhältnis von Primer zu Template ändert oder die Ionenstärke (mit MgSO4) sowie Zyklusparameter (Zeit und Temperaturen).

DNA Template

  • Der GENAXXON Red MasterMix ist besonders gut für weniger saubere Mausschwanz-DNA geeignet
  • Ungefähr 10E4 Kopien an Ziel-DNA werden benötigt, um nach 25-30 Zyklen ein detektierbares Produkt zu erhalten.
  • Benutzen Sie 1pg–1ng Plasmid-DNA oder virale DNA.
  • Benutzen Sie 1ng–1µg bei genomischer DNA.
  • Höhere DNA-Konzentrationen vermindern die Ampliconspezifität und ergeben z.B. Extrabanden, besonders wenn eine hohe Zyklenzahl eingesetzt wird.
  • Höhere DNA-Konzentrationen können eingesetzt werden, wenn kleinere Zyklenzahlen erwünscht sind, um z.B. die Spezifität zu erhöhen.

Primer

  • Generell sollten diese 20-30 Nukleotide in der Länge besitzen.
  • Der ideale GC-Gehalt liegt bei 40-60%.
  • Die GC-Basen sollten möglichst gleichmäßig über den/die Primer verteilt sein.
  • Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
  • Vermeiden Sie Sekundärstrukturen (z.B. Hairpins) innerhalb der Primer und der potentiellen Dimerisationsbereiche zwischen den verwendeten Primerpaaren.
  • Wenn gentechnisch veränderte Stellen (side directed mutagenesis) in die Primer eingebaut werden, dann ist es besser, wenn 5' von der side direkted mutagenesis Stelle noch 4-6 Extrabasen eingebaut werden, damit der Primer auch an der richtigen Stelle annealen kann.
  • Die Endkonzentration von jedem Primer sollte zwischen 0,05-1 µM liegen (0,05 µM ist die unterste Grenze), typische Werte liegen zwischen 0,1 und 0,5 µM.
  • Höhere Konzentrationen können eine erhöhte Primerdimerisierung zur Folge haben und falsche Amplifikationsprodukte "generieren" bzw. vortäuschen.
  • Bei Primern und Sonden kann man davon ausgehen, dass mit zunehmender Primermenge natürlich zunächst auch die PCR besser läuft (meistens ist zunächst ein früherer Ct-Wert zu erwarten). Mit weiter zunehmender Konzentration ist die PCR aber gesättigt. Neben einem etwas niedrigeren Ct-Wert wird anfänglich bei höherer Primer-/Sondenkonzentration meistens auch das Fluoreszenzsignal verstärkt.
  • Dazu kommen dann ggf. eine oder mehrere Sonden (hierbei sollte die notwendige Konzentration immer gut ausgetestet werden). Wir empfehlen zwischen 50-500 nM. In diesem Bereich sollten verschiedene Kombinationen ausgetestet werden.

Magnesiumkonzentration

  • 1,5-2,0 mM Mg2+ sind optimal für die Wirkung der Taq DNA Polymerase, jedoch hängt die optimale Mg2+ Konzentration sehr stark vom Template, der Pufferzusammensetzung, der Menge an DNA und auch an dNTPs ab, da vor allem die beiden letzteren eine hohe Tendenz haben, Magnesium zu chelatieren und damit der PCR-Reaktion zu entziehen.
  • Wenn [Mg2+] zu niedrig ist: Kein PCR-Produkt sichtbar.
  • Wenn [Mg2+] zu hoch ist: unerwünschte/falsche PCR-Produkte sind sichtbar. Eventuell ist nur noch ein Schmier zu sehen.

Deoxynukleotide (dNTPs >)

  • Die typische Konzentration beträgt 200 µM von jedem einzelnen dNTP. Grundsätzlich sind 200-400 µM an dNTPs aber eine gute Konzentration für die PCR.
  • Eine niedrigere Konzentration von 50-100 µM erhöht die Spezifität, reduziert aber die Ausbeute zum Teil deutlich.
  • Eine höhere Konzentration erhöht zwar die Ausbeute besonders bei langen Amplicons, reduziert aber die Spezifität deutlich.

DNA-Polymerase

  • Die Wahl der richigen Polymerase ist u.a. abhängig vom Verwendungszweck sowie vom eingesetzten Template (Standard-PCR: Taq DNA Polymerase S > mit hoher Genauigkeit, Taq Polymerase E > mit hoher Ausbeute; Mastermixe: Standard PCR MasterMix > oder Red MasterMix > mit rotem Farbstoff).
  • Für die Multiplex PCR gibt es spezielle lyophilisierte Multiplex MasterMixe >.
  • Zur Steigerung der Spezifität oder bei schwierigen Templates werden Hot Start Anwendungen empfohlen. Hierfür gibt es spezielle Hot Start Polymerasen >.
  • Für PCRs für Klonierungen oder andere Verfahren, die eine geringe Fehlerquote erfordern, gibt es thermostabile High Fidelity Proofreading Polymerasen wie
    Pfunds >, ExactRun >, ReproFast > oder ReproHot (KOD) Proofreading Polymerase >. Diese Enzyme machen weit weniger Fehler während der Amplifikation und erhöhen die Chancen auf ein fehlerfreies Amplicon.
  • Für Genotypisierungen und andere Anwendungen, bei denen eine hohe Unterscheidungsrate (high discrimination) benötigt wird, gibt es eine neue hochselektive DNA Polymerase, SNP Pol DNA Polymerase >. Sie unterscheidet fehlgepaarte Primer-Template Komplexe spezifisch und liefert gezielt nur PCR-Produkte bei perfekt passenden Primerpaaren.
  • Für die Real Time Quantitative PCR > gibt es hochspezialisierte qPCR Mastermixe. Hier kommt es bei der Wahl des richtigen Mastermixes auf das verwendete qPCR-Gerät an. So ist darauf zu achten, ob und wieviel ROX im qPCR Mastermix enthalten sein sollte und ob es eher ein Green qPCR Mastermix mit grünem Fluoreszenzfarbstoff > oder ein Probe qPCR MasterMix > ohne Fluoreszenzfarbstoff sein muss. Diesen gibt es auch lyophilisiert bei Raumtemperatur stabil in Beads (LyoBalls >).
  • Die Menge an eingesetzter DNA-Polymerase in der PCR-Reaktion kann das PCR-Ergebnis signifikant beeinflussen (verwenden Sie 1,25 - 1,5 units Taq-Polymerase > für einen 50µL-Ansatz).

Annealing

  • Die Annealingtemperatur sollte mit einem Temperaturgradienten optimiert werden. Auch die Annealingzeit hat einen Einfluss auf das Gelingen. Es gilt, dass der Einsatz eines anderen Mastermixes oder der Einsatz eines Reaktionspuffers eines anderen Anbieters einen gravierenden Einfluß auf die Annealingtemperatur haben kann.
  • Die Schmelztemperaturen beider Primer eines Primerpaares sollten nicht mehr als 5°C voneinander abweichen.
  • Typische Annealingtemperaturen liegen ca. 5°C unterhalb des niedrigsten Tm der eingesetzten Primer. Oft fallen die Temperaturen in den Bereich von 50-60°C.
  • Höhere Annealingtemperaturen sollten getestet werden, wenn es zu unspezifischen Banden oder einem Schmier kommt.
  • Typsiche Annealingzeiten liegen im Bereich von 15-30 Sekunden.

Extensionstemperatur und -zeiten

  • Die Amplicon-Verlängerung wird normalerweise bei 68°C durchgeführt.
  • Als allgemeine Regel kann man bei Standard Taq-Polymerasen pro 1000 Basenpaaren von 1 Minute Extensionszeit bei 68°C ausgehen (oder 2 Minuten für 2000 Basenpaare, bzw. 3 Minuten für 3000 Basenpaare).
  • Für PCR-Produkte, die kleiner als 1 kb sind, können 45-60 Sekunden genommen werden (eher 45 Sekunden, wenn es sich nicht um ein Amplicon nahe 1 kb handelt).
  • Sowohl bei PCR-Produkten, die länger als 3000 Basenpaare sind, als auch bei PCR-Protokollen, die mehr als 30 Zyklen haben, ist es wahrscheinlich, dass längere Extenstionszeiten benötigt werden. Daher sollte bei längeren Amplicons oder bei höheren Zyklenzahlen nochmals optimiert werden.

Die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt, starken Sekundärstrukturen, niedrigen Konzentrationen oder Amplicons größer 5 kb benötigen sehr oft eine Optimierung der PCR-Bedingungen. Typischerweise sollten 15-30 Sekunden Denaturierung bei 95°C während der PCR durchgeführt werden.

 
 
 
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Referenzen..

Hier finden Sie Artikel und Literaturzitate, in denen die Autoren auf die hohe Qualität dieses GENAXXON-Produkts vertrauen.
Listed below are articles and references, in which the authors trust in the high quality of this Genaxxon product.

Quelle/Source: NCBI PubMed >

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Archile Paguem, Babette Abanda, Dieudonné Ndjonka, Judith Sophie Weber, Sen Claudine Henriette Ngomtcho, Kingsley Tanyi Manchang, Mamoudou Adoulmoumini, Albert Eisenbarth, Alfons Renz, Sørge Kelm, Mbunkah Daniel Achukwi
BMC Vet Res. 2019; 15: 344. Published online 2019 Oct 16. doi: 10.1186/s12917-019-2111-6
PMCID: PMC6796345

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PMCID: PMC6737592

Impact of Alternatively Polyadenylated Isoforms of ETHYLENE RESPONSE FACTOR4 with Activator and Repressor Function on Senescence in Arabidopsis thaliana L.
Lena Riester, Siliya Köster-Hofmann, Jasmin Doll, Kenneth W. Berendzen, Ulrike Zentgraf
Genes (Basel) 2019 Feb; 10(2): 91. Published online 2019 Jan 28. doi: 10.3390/genes10020091
PMCID: PMC6409740

Recruitment of Cytosolic J-Proteins by TOM Receptors Promotes Mitochondrial Protein Biogenesis
Łukasz Opaliński, Jiyao Song, Chantal Priesnitz, Lena-Sophie Wenz, Silke Oeljeklaus, Bettina Warscheid, Nikolaus Pfanner, Thomas Becker
Cell Rep. 2018 Nov 20; 25(8): 2036–2043.e5. Published online 2018 Nov 20. doi: 10.1016/j.celrep.2018.10.083
PMCID: PMC6280124

Membrane protein insertion through a mitochondrial β-barrel gate

Alexandra I.C. Höhr, Caroline Lindau, Christophe Wirth, Jian Qiu, David A. Stroud, Stephan Kutik, Bernard Guiard, Carola Hunte, Thomas Becker, Nikolaus Pfanner, Nils Wiedemann

Science. Author manuscript; available in PMC 2018 Jul 19.

Published in final edited form as: Science. 2018 Jan 19; 359(6373): eaah6834. doi: 10.1126/science.aah6834

PMCID: PMC5959003

 

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Andrea Schampel, Oleg Volovitch, Tobias Koeniger, Claus-Jürgen Scholz, Stefanie Jörg, Ralf A. Linker, Erhard Wischmeyer, Marie Wunsch, Johannes W. Hell, Süleyman Ergün, Stefanie Kuerten

Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Apr 18; 114(16): E3295–E3304. Published online 2017 Apr 5. doi: 10.1073/pnas.1620052114

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Laura Hühner, Jennifer Rilka, Ralf Gilsbach, Xiaolai Zhou, Venissa Machado, Björn Spittau

Front Mol Neurosci. 2017; 10: 62.  Published online 2017 Mar 9. doi: 10.3389/fnmol.2017.00062

PMCID: PMC5343015

Asexual Recombinants of Plasmopara halstedii Pathotypes from Dual Infection of Sunflower

Otmar Spring, Reinhard Zipper

PLoS One. 2016; 11(12): e0167015.  Published online 2016 Dec 1. doi: 10.1371/journal.pone.0167015

PMCID: PMC5132302

 

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Babette Abanda, Archile Paguem, Mamoudou Abdoulmoumini, Manchang Tanyi Kingsley, Alfons Renz, Albert Eisenbarth

Parasit Vectors. 2019; 12: 448. Published online 2019 Sep 11. doi: 10.1186/s13071-019-3699-x

PMCID: PMC6737592



 
 
 
FAQ
Fragen & Antworten zum Artikel ... mehr
Does the red dye included in the Red MasterMix (2x) interfere with the PCR performance?
No, the included red dye does not interfere with the PCR performance. If necessary, the red dye can be removed, e.g., by spin column purification.
Can I use my own cycling conditions when using the Red MasterMix (2x)?
Yes, you can use your own cycling conditions. Please note that the cycling conditions in our protocol are only guidelines for PCR amplification. Optimal reaction conditions such as incubation times, temperatures, and amount of template DNA may vary and must be determined individually.
What starting quantity of template DNA do I need for PCR when using the Red MasterMix (2x)?
You need approximately 10E4 copies of target DNA to detect product in 25-30 PCR cycles.
Do I need additional MgCl2 when using the Red MasterMix (2x)?
The Red MasterMix (2x) provides a final concentration of 1.5mM MgCl2 which will give satisfactory results in most cases. However, the ideal concentration depends on the template, buffer, DNA and dNTPs, as each has the potential to chelate magnesium. If the Mg2+ concentration is too low, no PCR products will be seen. In these cases it may be necessary to add additional MgCl2.