SNP-Genotypisierung und ihre Anwendungen

Fortschritte auf dem Gebiet
der SNP-Genotypisierung und ihrer Anwendungen

SNPs (Single Nucleotide Polymorphism, Einzelbasenaustausche) oder Punktmutationen
sind die häufigste Art genetischer Variationen. Sie bestimmen damit den Großteil der
phänotypischen Diversität zwischen Individuen.

Verändern Punktmutationen die Aminosäuresequenz in Proteinen, dann sind SNPs direkt an der Eigenschaftsausbildung eines jeden Individuums involviert. Abhängig von der untersuchten Spezies können diese Charakteristika die Resistenz/Empfänglichkeit gegenüber einer bestimmten Erkrankung beim Menschen, den Milch- oder Fleischertrag bei Nutztieren oder auch die Trockenresistenz oder den Ertrag bei Getreide betreffen.

Die Technik des Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) oder SNP-Genotypisierung gibt es schon längere Zeit. Ihre Anwendung für die Entwicklung von Hochdurchsatztechniken ist gerade in der Entwicklung begriffen.
SNPs sind in großer Zahl in den Genomen zu finden und sind nützlich bei der Identifizierung von wichtigen Merkmalen. SNPs sind von besonderem Interesse für Pflanzenforscher, da sie als molekulare Marker dazu benutzt werden können, die natürliche genetische Variabilität und die genetische Drift zu identifizieren und so eine Verbesserung von Nutzpflanzen zu fördern. Dieser Fakt, zusammen mit der Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS) und durch die deutlich reduzierten Kosten von NGS, revolutioniert gerade das Feld der Agrarforschung.

Was für Wissenschaftler noch spannender sein könnte, ist die Entwicklung auf dem Gebiet der Klonierung wichtiger QTLs und der Charakterisierung funktioneller SNPs. Dadurch können verbesserte prädiktive Marker erzeugt werden, die für die gezielte Selektion eingesetzt werden können. Der aktuelle Fokus für Wissenschaftler ist es, die SNP-Genotypisierung mit anderen leistungsfähigen Methoden zu kombinieren, um die Anwendungen zu verbessern.

Lassen Sie uns kurz dazu, einige von ihnen näher beleuchten.

1) SNPs als Wegweiser in der Pflanzenzucht am Beispiel des Mais
Landwirtschaftlich interessante Merkmale werden oft durch mehrere Gene gesteuert. So kann die Größe eines Maiskorns von mehreren hundert Genen abhängen, die auf komplexe Weise zusammenspielen. Um Licht in das Zusammenspiel der Gene zu bringen,nutzen die Wissenschaftler Genmarker. Das sind winzige, eindeutig identifizierbare Abschnitte, zumeist SNP´s, in denen sich die DNA-Stränge verschiedener Individuen unterscheiden.
Die Genmarker (SNP´s) werden häufig zusammen mit den Genen vererbt, die für das untersuchte Merkmal verantwortlich sind und können deshalb als Wegweiser zu den Genen benutzt werden.
Mit Hilfe dieser Genmarker lässt sich ein genetischer Fingerabdruck von Pflanzenlinien erstellen. Die so gewonnenen Genomprofile können nach Regelmäßigkeiten durchsucht werden und dann zum Beispiel mit gemessenen Ertragsunterschieden in Verbindung gesetzt werden.
Das Ziel der Untersuchungen ist, bereits aus dem genetischen Code eines Samenkorns vorhersagen zu können, welches Ertragspotenzial die Pflanze verspricht.

2) Alleldiskriminierung bei polyploiden Arten (Runge et al., IdentXX, Stuttgart)
Untersucht wurde die Hühnerhirse, ein Unkraut beim Maisanbau, deren Gene in drei diploiden Varianten vorliegen.
Um das Unkraut zu bekämpfen, werden Acetolactat-Synthase (ALS) Hemmer eingesetzt. Treten Punktmutationen an bestimmten Positionen des ALS Gens auf, ändert sich die Struktur der ALS und der hemmende Wirkstoff kann nicht mehr binden. Das führt zu einer Resistenz des Unkrauts gegen das Herbizid.
Um zu untersuchen, welche Bedeutung einzelne Mutationen in verschiedenen Genvarianten für die Herbizidresistenz haben, wurde der SNP Pol DNA-Polymerase 2X PCR-Mastermix von GENAXXON dafür eingesetzt, die polyploiden Proben mittels Allel-spezifischer PCR voneinander zu trennen und danach wie diploide Proben zu analysieren.

3) SNP-Analyse kombiniert mit Simple Sequence Repeats (SSR) zur Identifizierung von QTLs
Eine Gruppe von Wissenschaftlern kombinierte Simple Sequence Repeats (SSR)-Marker zusammen mit den Bulked Segreganten- und SNP-Analysen (BSA und SNP), um QTLs durch eine zusammengesetzte Intervallkartierung zu identifizieren.
Diese QTLs können für die Feinkartierung und Marker unterstützte Selektion (MAS) verwendet werden. MAS werden genutzt, um eine lang anhaltende Resistenz gegen bestimmte Krankheiten wie Blattrost (Puccinia recondite f. sp. Tritici) zu erreichen.

4) SNP-Genotypisierung kombiniert mit quantitativer Genotypisierungs-PCR (qgPCR) zur Unterstützung von CRISPR-Editoren
Wussten Sie, dass es Berichte über unbeabsichtigte CRISPR-induzierte On-Target-Effekte (OnTEs) gibt, die zu „Loss of heterozygosity“ (LOH) führen?
OnTEs werden bei der Standard-Sanger-Sequenzierung oft fälschlicherweise als korrekt editiert eingestuft.
OnTEs können den Phänotyp der editierten Zellen oder Organismen stark beeinträchtigen.
Dies würde die Zuverlässigkeit der gesamten Technik in Frage stellen. Eine wissenschaftliche Gruppe hat daher ein Protokoll entwickelt, um diese OnTEs mittels SNP-Genotypisierung zu erkennen.
Das Protokoll beginnt mit dem Ausschluss von Klonen mit monoallelischen OnTEs und hemizygoter Editierung durch Bestimmung der Anzahl der intakten Allele am Zielort. Dies geschieht durch quantitative Genotypisierungs-PCR (qgPCR) der genomischen DNA, anschließend werden die LOH durch Genotypisierung benachbarter Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) identifiziert. Das hört sich sehr komplex an, aber ich bin mir sicher, dass es für alle Forscher da draußen ein Kinderspiel ist. Ist es das nicht?

5) Erhöhte SNP mit hs-CRISPR-System
In einer kürzlich durchgeführten Forschungs-Studie wurde das CRISPR/Cas13a-System mit einer Strategie erweitert, die als hs-CRISPR bezeichnet wird. Das System ist mit gewöhnlicher crRNA vergleichbar:
a) Es zeigt eine hohe on-target Affinität von Cas13a, bei gleichzeitiger Unterdrückung der off-target Aktivität, unter Verwendung von CRISPR-RNA (crRNA) mit Hairpin-Spacer.
b) Es besitzt eine mindestens 3-fach höhere Sensitivität und Unterscheidungsfähigkeit des Cas13a System.
c) Es kann innerhalb von 1 Stunde durchgeführt werden.
d) Es ist kompatibel mit dem traditionellen Cas13a-System.
Die erhöhte Spezifität von CRISPR/Cas13a kann zur Erweiterung der SNP-Genotypisierung genutzt werden. Durch die Genotypisierung, die auf dem verbesserten hs-CRISPR (hairpin spacer-CRISPR) System basiert, sind die Techniken einfacher zu handhaben, leichter zu programmieren und damit einfach schneller.

6) SNP-seq-Genotypisierungstechnologie zur Identifizierung von Gemüsesorten mittels DNA-Fingerprinting
Im Jahr 2020 wurde in China eine Studie mit 261 Gurkensorten durchgeführt, um die Anwendung der SNP-seq-Genotypisierungstechnologie bei der Sortenidentifikation zu bewerten. Dies geschah durch Konstruktion einer Ziel-SNP-seq-Bibliothek. Mit dieser Technologie wurde ein DNA-Fingerabdruck von 261 Gurkensorten mit 163 perfekten SNPs erstellt.

GENAXXON bietet nicht nur SNP Polymerase MasterMix  sondern auch SNP Polymerase 
und SNP Taq Polymerase an, die diese Technologien ergänzen und Ihre Präzision auf ein
neues Niveau heben. 

Diese SNP Polymerasen von GENAXXON können mit ähnlichen Protokollen kombiniert werden, um noch spezifischere Ergebnisse zu erzielen. Es wird Unmögliches möglich: mutierte Allele können ohne Sequenzierung von Wildtyp-Allelen unterschieden werden!   

Ja, Sie haben es richtig gelesen!

Die GENAXXON SNP Pol DNA-Polymerase (Artikel Nr. M3009), SNP PolTaq DNA-Polymerase (Artikel Nr. M3025) und unser GENAXXON SNP Pol DNA-Polymerase Mastermix (Artikel-Nr. M3061) unterscheiden mit hoher Spezifität, ob ein Mismatch des Primer-Template-Komplexes vorhanden ist oder nicht. Die Fehlpaarung (Punktmutation) muss am 3'-Ende des Primers liegen. Der Trick dabei ist, dass die Polymerase bei einer Fehlpaarung nicht amplifiziert.

Das ist nur eine von mehreren Anwendungsmöglichkeiten unserer SNP-Polymerase. Weitere wichtige Anwendungen der GENAXXON SNP-Polymerasen sind:

  • Überwachung, Verifizierung und Nachweis von Punktmutationen
  • Validierung von CRISPR/Cas9-Produkten
  • Quantifizierung von Mutationen (z.B. bei NGS-Ergebnissen)
  • Allel-spezifische Amplifikation (ASA)
  • Methylierungsspezifische PCRs (MSP) nach bisulfitbehandelter DNA (CpG-Methylierungsseiten)
  • HLA-Genotypisierung
  • Mikro-Sequenzierung
  • Realtime PCR mit Hydrolyse-Sonden
  • Realtime-Multiplex-PCRs

Referenzen:

http://www.plantbreedbio.org/journal/view.html?doi=10.9787/PBB.2014.2.3.195
https://link.springer.com/article/10.1186/s12870-015-0689-9
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202003611
https://www.nature.com/articles/s41598-020-62518-6
https://www.wzw.tum.de/uploads/media/Reportage_%C3%BCber_neue_Z%C3%BCchtungsmethoden_in__Faszination_Forschung_.pdf
Fabian Runge et al. (2020), IdentXX GmbH, Stuttgart

 

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