Mit genetischer Modifikation gegen die Klassische Schweinepest: Schwein gehabt?

Mit genetischer Modifikation gegen die Klassische Schweinepest: Schwein gehabt?

Die Klassische Schweinepest (KSP) gilt als eine der bedeutendsten Tierseuchen weltweit. Sie verursacht bei einem Seuchenausbruch hohe ökonomische Schäden und Verluste. Versuche zur Ausrottung schlugen bisher fehl. Der letzte seuchenhafte Ausbruch in Deutschland war Mitte der 90er Jahre.
Die KSP ist eine hochansteckende, anzeigepflichtige Viruserkrankung von Haus- und Wildschweinen mit hoher Sterblichkeit. Das bedeutet, dass europaweit strenge Vorgaben im Falle eines Seuchenausbruchs gelten. Diese umfassen die Errichtung von Sperr- sowie von Beobachtungsgebieten. Alle Tiere innerhalb des Sperrgebiets werden getötet (Keulung) und die Tierkörper unschädlich beseitigt. In beide Zonen dürfen keine Schweine mehr verbracht oder daraus ausgeführt werden. Alle schweinehaltenden Betriebe innerhalb dieser Zonen werden vom innergemeinschaftlichen Handel sowie vom Handel mit Drittländern ausgeschlossen.
Eine prohylaktische Impfung von Hausschweinen gegen diese Tierseuche ist seit den 90er Jahren vor allem aufgrund handelspolitischer Gesichtspunkte EU-weit verboten.

Die KSP wird durch ein Pestivirus aus der Familie Flaviviren hervorgerufen. Sie ist nicht auf andere Tierarten oder den Menschen übertragbar. Wildschweine bilden das wichtigste Erregerreservoir. Aber auch das Einbringen von subklinisch infizierten Schweinen stellt eine Gefahr dar sowie die Übertragung durch Vektoren. Dazu gehören kontaminierte Gerätschaften und Spritzen (iatrogene Übertragung) sowie an der Kleidung anhaftende Partikel. Aus diesen Gründen ist eine optimale Stallhygiene unabdingbar.

Eine Ansteckung erfolgt hauptsächlich peroral oder über die Atemwege direkt von Tier zu Tier. Die Inkubationszeit beträgt zwischen 2-8 Tagen bis über 5 Wochen, je nach Virulenz des Erregers. Das Virus wird über Kot, Harn, Speichel, Augen- und Nasensekret ausgeschieden. Die Ausscheidung erfolgt ständig, bereits kurze Zeit nach einer Infektion bis zum Tode des Tieres. Selbst große Schweinebestände können so innerhalb einer Woche vollständig infiziert werden.

Das klinische Bild einer Erkrankung ist meist nicht eindeutig und variabel ausgeprägt. Der akute Verlauf einer Infektion geht einher mit hohem Fieber bis 41 °C und Inappetenz. Dazu können zentralnervöse Störungen und zyanotische und hämorrhagische Symptome (Blutungsneigung) kommen, oftmals kommt es zu respiratorischen und enterobakteriellen Sekundärinfektionen. Es erfolgen vermehrt Aborte im Betrieb. Infizierte Tiere verenden meist innerhalb von ein bis zwei Wochen.
Daneben gibt es noch eine chronische Verlaufsform mit abgeschwächten Symptomen. Ein generelles Fehlen von Symptomen schließt eine Infektion mit der KSP jedoch nicht aus. Der direkte Nachweis erfolgt über Immunfluoreszenz an Gewebsteilen sowie über die direkte Erregeranzüchtung aus dem Blut.

Chinesischen Wissenschaftlern ist es gelungen, das Erbgut von Schweinen so zu verändern, dass sie gegen das KSP-Virus resistent sind. Dabei wurde eine Kombination der CRISPR/Cas9-Methode > und der RNA-Interferenz (RNAi)-Technologie angewandt. RNAi ist ein natürlicher post-transkriptioneller Gen-Silencing-Mechanismus. Antivirale siRNA wurde dabei mit der CRISPR/Cas9-Methode in das Schweinegenom eingeschleußt. Die Mutation konnte stabil auf die F1-Generation übertragen werden.
 
Zunächst wurden antivirale siRNA-Sequenzen identifiziert, deren Expression die Replikation des KSP-Virus verhindert, und small hairpin shRNA-exprimierende Targetingvektoren hergestell. Diese Vektoren wurden daraufhin in den pRosa26-Lokus von porcinen fetalen Fibroblasten mit dem CRISPR/Cas9-Vektor durch knock-in mit Hilfe des Gen-Editing-Tools CRISPR/Cas9 eingeschleust. Rosa26 wird ubiquitär in embryonalen und adulten Geweben exprimiert. Die Knock-In-Resultate wurden mittels PCR > und Sequenzierung bestätigt. Die so erhaltenen transgenen Fibroblasten wurden mit dem KSP-Virus infiziert. In den Zellkulturen konnte daraufhin eine antivirale Aktivität mittels qPCR > nachgewiesen werden.
Die Zellen wurden verwendet, um im nächsten Schritt transgene porcine Schweineembryonen herzustellen. Diese wurden Sauen implantiert. Es konnten auf diesem Weg 12 weibliche, voll entwickelte und lebensfähige Ferkel erzeugt werden, in denen die antivirale RNA mittels qPCR > nachgewiesen werden konnte.

Die F1-Generation wurde mit nicht transgenem Samen erzeugt. Ein Teil dieser Nachkommen wies das Genom für KSP-Resistenz auf. Die genetische Modifikation war also stabil vererbt worden.
Schließlich wurden sowohl die transgenen Schweine als auch eine Kontrollgruppe mit dem KSP-Virus infiziert. Alle nicht transgenen Schweine verstarben akut. Die genetisch modifizierten Schweine wiesen nur schwache Symptome auf und die Viruslevel im Blut waren deutlich niedriger.
Durch die Resistenz könnten die hohen wirtschaftlichen Verluste deutlich reduziert werden. Nach Meinung der Autoren könnte dieses Modell der genetischen Modifikation auch auf andere virale Erkrankungen und Tierarten anwendbar sein. Zunächst müssen aber Langzeitstudien vorgenommen werden, z.B., ob die Resistenz permanent erhalten bleibt und ob es weitere Auswirkungen der genetischen Modifikationen gibt.

Von Genaxxon erhalten Sie unter anderem folgende Cas9-Proteine: Cas9-NLS (Nuklease, Wildtyp) >, Cas9-NLS-tagRFP (Nuklease mit rot fluoreszierendem Proteinmarker) >, Cas9-Dead-NLS >, Cas9-Dead-NLS-EGFP >.
Produkte für RNAi: esiRNA - Negative Controls >, esiRNA - Positive Controls >

Quelle:
Xie, Z., et al. “Genetically modified pigs are protected from classical swine fever virus.”  PLoS Pathog. 2018 Dec 13;14(12):e1007193. doi: 10.1371/journal.ppat.1007193.

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