Probleme mit unspezifischen Banden nach Ihrer PCR? Die PCR funktioniert nicht, Sie finden aber jede Menge amplifizierter Primer-Dimere? Keine Lust auf Hektik und Kühlung beim Pipettieren Ihrer PCR und den nachfolgenden Schritten? Reproduzierbare Ergebnisse Sommers wie Winters? Dann nutzen Sie doch einfach eine Hot-Start PCR.
Vielleicht kennen Sie es: Auch wenn Sie beim Pipettieren Ihrer PCR keinen Fehler gemacht haben, können die Ergebnisse manchmal deprimierend und enttäuschend sein. Wie kann das sein? Herkömmliche DNA-Polymerasen sind bereits bei Raumtemperatur aktiv – und dies kann zu einer Vielzahl „falsch amplifizierter“ Templates, falsch-positiven Ergebnissen und geringer Ausbeute führen.
Um dies zu verhindern, könnten Sie selbstverständlich die entscheidenden Komponenten für die PCR erst zur Reaktion geben, wenn Sie das Reaktionsgemisch auf mindestens 55°C erwärmt haben. Doch das ist kompliziert und aufwändig – keine gute Kombination für eine gelungene und effektive Laborarbeit. Doch was ist die Lösung? Findige Wissenschaftlerinnen hatten in den späten 1980er Jahren die Idee: Sie entwickelten die Hot-Start PCR – eine Technik, bei der die DNA-Polymerase inhibiert wird, bis ein Wärme-Aktivierungsschritt erfolgt. So wird im Wesentlichen die Enzymaktivität während der Initiierungsphase der PCR unterdrückt - die Amplifikation beginnt erst, wenn die optimale Temperatur erreicht ist.
Warum ist das entscheidend?
Die DNA wird während der PCR-Zyklen exponentiell amplifiziert. Treten Fehler bereits während den ersten Zyklen auf, werden diese in jedem PCR-Zyklus akkumuliert. Daher ist es besonders wichtig, eine fehlerhafte Amplifikation zu Beginn der PCR zu vermeiden. Die Hot-Start-Technik kann hier entscheidend dazu beitragen. Die Amplifikation kann so also vor allen Dingen in den ersten PCR-Zyklen möglichst fehlerfrei verlaufen – und gerade diese ersten PCR-Zyklen sind entscheidend, um genau und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.
Über die Zeit haben sich 3 prinzipielle Inhibierungsverfahren etabliert, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. In diesem Blogbeitrag werden wir die gängigsten Inhibitionstechniken zur Enzymhemmung vergleichen und die jeweiligen Vor- und Nachteile beleuchten.
Welche verschiedenen Methoden der Enzymhemmung gibt es?
Bei der Hot-Start-PCR kann die Enzymaktivität bei Raumtemperatur durch verschiedene Inhibitoren gehemmt werden. Bei der anschließenden Erhitzung während der PCR-Zyklen löst sich die DNA-Polymerase von dem Inhibitor und beginnt mit der Polymerisation.
Methode #1: Chemische Inhibierung
Bei der chemischen Inhibierung der DNA-Polymerase wird das Enzym kovalent mit chemischen Gruppen verbunden, um so die Enzymaktivität bei Raumtemperatur zu blockieren. Vorteile der chemischen Enzymhemmung ist ein geringes Kontaminationsrisiko sowie eine hohe Stabilität der chemischen Inhibitoren. Dies führt auch zu einer beständigen Performance, sodass meist aufwändige Optimierungsschritte des Protokolls wegfallen. Ein weiterer Vorteil der chemischen Inhibierung ist die Möglichkeit einer schrittweisen Aktivierung des Enzyms, da ein Teil der DNA-Polymerase bei der ersten Wärmeaktivierung inaktiv bleibt und erst während den weiteren Zyklen letztlich aktiviert. Es wird allmählich Enzym „nachgeliefert“ und so die Reaktion verstärkt. Dies kann zu einer höheren Effizienz führen. Während andere Polymerasen im Laufe der PCR eher abschwächen, kann die chemisch modifizierte DNA-Polymerase durch die schrittweise Aktivierung eine höhere Performance auch in späteren PCR-Zyklen aufweisen.
Nachteile dieser Methode umfassen vor allen Dingen die Notwendigkeit einer längeren Aktivierungszeit. So kann es teilweise mehr als 10 Minuten dauern, um den chemischen Inhibitor von der DNA-Polymerase zu lösen. Während dieser Zeit könnte Ihre Template-DNA auch durch die Hitze beschädigt werden. Daher ist diese Methode meist für Fragmente länger als 3kb ungeeignet. Zudem ist es meist auch nicht möglich, den chemischen Inhibitor vollständig von der Polymerase zu lösen, sodass die Reaktion nicht in vollem Umfang stattfinden kann.
Methode #2: Antikörper-modifizierte DNA-Polymerasen
Bei antikörper-modifizierten Hot-Start-Polymerasen bindet ein monoklonaler Antikörper an das aktive Zentrum des Enzyms und blockiert so die Aktivität. Durch den hot-start denaturiert der Antikörper und löst sich so vom aktiven Zentrum der DNA-Polymerase, die damit aktiviert wird. Nach diesem Wärme-Aktivierungsschritt verhält sich das Enzym dann prinzipiell wie eine herkömmliche Standard-Taq-Polymerase. Dies hat im Vergleich zur chemischen Inhibierung vor allen Dingen den Vorteil, dass es sich damit um einen schnelleren Prozess handelt, da der Denaturierungsschritt der PCR die DNA-Polymerase komplett aktiviert. Nach diesem kurzen Denaturierungsschritt (1-3 Minuten) ist die DNA-Polymerase vollumfänglich aktiviert. Nachteil dieser Methode ist der meist tierische Ursprung der Antikörper sowie eine mögliche Verunreinigung durch den höheren Anteil an Antikörpern in der Reaktion, was vor allen Dingen bei der Verwendung von Ziel-DNA aus Säugetieren eine Rolle spielen könnte.
Methode #3: Aptamer-Inhibierung
Prinzipiell funktioniert die Aptamer-Inhibierung der DNA-Polymerase ähnlich wie die Inhibierung mit Antikörpern. Statt den Antikörpern binden aber spezifische Aptamere, sprich Oligonukleotide, an das aktive Zentrum des Enzyms, bis dieses dann durch den Wärmeaktivierungsschritt wieder frei wird. Größter Vorteil dieser Methode ist die sehr schnelle Aktivierungszeit (meist nur 30 Sekunden). Zudem sind die Oligonukleotide nicht tierischen Ursprungs. Nachteilig ist allerdings, dass die Oligonukleotide meist weniger stringent binden und es so zu unspezifischen Amplifikationen kommen kann.
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