Die realtime PCR, auch als qPCR bekannt, ist zweifelsohne eine beeindruckende Methode, um die Amplifikation der Ziel-DNA in Echtzeit zu messen. Doch manch einer mag bei der Fülle an Begriffen, Protokollen und Kits auf dem Markt schier verzweifeln. Da stellt man sich gerne die Frage: Sind verlässliche Ergebnisse der qPCR nur durch Zauberei erreichbar oder geht es am Ende doch vielmehr um die Kunst einer präzisen Feinabstimmung?
Da können wir Sie beruhigen: Tatsächlich können Sie mit nur wenigen Kniffen Ihre qPCR so optimieren, dass sie problemlos verlässliche und genaue Ergebnisse erzielen. Ob Sie bereits ein Experte/eine Expertin auf dem Gebiet der qPCR sind oder gerade erst die ersten Schritte in diese faszinierende Welt unternehmen, dieser Artikel führt Sie durch die entscheidenden Faktoren, die Ihre qPCR-Assays zu bestmöglichen Ergebnissen führen. Von der Entscheidung der Methode, über die Qualitätskontrolle bis hin zur Optimierung der Spezifität – wir haben wichtige Tipps und Anregungen für Sie.
Worauf Sie achten sollten, wenn Sie Ihren qPCR Assay planen?
High ROX, Low ROX or No ROX?
Ein interner passiver Referenzfarbstoff wie ROX wird in der qPCR verwendet, um die Fluoreszenzsignale innerhalb des Gerätes zu normalisieren. Dies ist vor allen Dingen bei älteren qPCR Cyclern wichtig, die stationäre Lichtquellen und Detektionssysteme haben, da unterschiedliche Lichtwege im Gerät letztlich unterschiedliche Fluoreszenzsignale zwischen den Wells ergeben würden. Eine fehlende Normalisierung der gemessenen Fluoreszenzwerte würde zu Verzerrungen und Ungenauigkeiten in den qPCR-Ergebnissen führen.
qPCR Cycler verschiedener Hersteller haben unterschiedliche optische Konfigurationen, die wiederum unterschiedliche ROX-Konzentrationen als Basiswert für die Normalisierung benötigen. Sie sollten daher bei Ihrem Gerätelieferanten klären, ob und wenn ja, welche ROX-Konzentration/ROX-Menge für Ihr Gerät benötigt wird.
Um den unterschiedlichen Anforderungen gerecht zu werden, bietet Genaxxon entsprechend konfigurierte qPCR Mastermix an. Unsere qPCR Mastermixe wie der GreenMasterMix oder der ProbeMasterMix sind mit verschiedenen ROX-Konzentrationen erhältlich (No ROX, Low ROX oder High ROX). Wählen Sie einfach den passenden qPCR Mastermix für Ihren spezifischen qPCR Cycler aus.
Probe oder SYBR-Green?
In der qPCR stehen Ihnen verschiedene Methoden zur Verfügung. Die beiden am häufigsten verwendeten Ansätze umfassen die qPCR mit interkalierenden Farbstoffen wie SYBR-Green oder Genaxxons Green DNA dye sowie die qPCR mit fluorogenmarkierten Hydrolyse-Sonden wie TaqMan. Zusätzlich existieren weitere sondenbasierte qPCR-Methoden, die ohne Hydrolyse auskommen, darunter Molecular Beacons oder Scorpion-Primer. Dieser Artikel widmet sich den beiden gängigsten Methoden – der qPCR mit interkalierenden Farbstoffen und der sondenbasierten qPCR mit Hydrolyse-Sonden.
Interkalierende Farbstoffe wie SYBR-Green und Genaxxons Green DNA dye binden an doppelsträngige DNA und erzeugen nach erfolgreicher Bindung ein Fluoreszenzsignal, das während der PCR-Reaktion proportional zur Menge der erzeugten PCR-Produkte ansteigt. Dies ermöglicht eine direkte Detektion der Amplifikation in Echtzeit. Allerdings ist ein sorgfältiges Primer-Design entscheidend, um unspezifische Bindungen und falsch positive Signale zu vermeiden. Daher ist eine anschließende Qualitätskontrolle mittels Schmelzkurvenanalyse bei der Verwendung von interkalierenden Farbstoffen unerlässlich.
Fluorogenmarkierte Hydrolyse-Sonden wie TaqMan dagegen sind mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff am 5'-Ende und einem Quencher-Farbstoff am 3'-Ende ausgestattet. Während der PCR-Reaktion spaltet die 5'-Nukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Sonde, was zu einem Fluoreszenzsignal führt. Mit jeder Amplifikationsrunde wird mehr Reporter-Farbstoff freigesetzt, wodurch ein spezifisches Signal entsteht, das proportional zur PCR-Produktmenge ist.
Hydrolyse-Sonden wie TaqMan eignen sich hervorragend für Anwendungen wie die SNP-Genotypisierung, die Analyse von Spleißvarianten und den Nachweis von Mutationen mittels qPCR. Im Gegensatz dazu sind SYBRGreen-basierte Assays ideal für Genexpressions- oder miRNA-Expressionsanalysen und bieten zusätzliche Vorteile, einschließlich Qualitätsmetriken wie Schmelzkurvenanalyse.
Doch was sind Vor- und Nachteile beider Methoden?
Die interkalierenden Farbstoffe wie SYBR-Green und Genaxxons Green DNA dye sind kostengünstiger und erlauben eine breitere Anwendung. Jedoch erfordern sie ein besonders präzises Primer-Design, um falsche Signale zu vermeiden und eine anschließend notwendige Qualitätskontrolle mittels Schmelzkurvenanalyse. Auf der anderen Seite sind sondenbasierte qPCR-Ansätze kostenaufwändiger, ermöglichen aber auch Multiplexing-Ansätze. Zudem erfordern sie weniger Nachbearbeitung, da keine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt wird. Zu den Schlüsselfaktoren für den Erfolg gehören in beiden Fällen die Auswahl geeigneter Primer, die Optimierung des qPCR-Mastermixes und die Sicherstellung qualitativ hochwertiger, nicht fragmentierter cDNA.
Grundsätzlich ist zu sagen, dass mehrere wissenschaftliche Studien darauf hindeuten, dass ein ordnungsgemäß optimierter SYBRGreen-Assay für die Genexpressionsanalyse ebenso effektiv ist wie eine Hydrolyse-Sonde (TaqMan) (z. B. Tajadini et. al. 2014: Comparison of SYBR Green and TaqMan® methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes, Advanced Biomedical Research, 3, 85, DOI: 10.4103/2277-9175.127998).
Die Wahl zwischen den beiden Methoden sollte daher Ihren spezifischen Anforderungen und dem verfügbaren Budget entsprechen. Wir von Genaxxon bieten Ihnen spezifische Mastermixe für beide Methoden an: Den ProbeMasterMix für sondenbasierte qPCR sowie den GreenMasterMix, der den interkalierenden Farbstoff bereits enthält. Daneben bieten wir auch spezielle Multiplex-Mastermixe wie den 5X qPCR Multiplex PCR Mastermix mit einer optimierten Polymerase für eine robuste qPCR-Leistung. Lesen Sie dazu auch gerne unseren Blogbeitrag mit 3 Gründen, warum auch Sie den 5X qPCR Multiplex PCR Mastermix nutzen sollten.
Sie wissen nun, welche ROX-Konzentration Ihr qPCR Cycler benötigt und welche qPCR-Methode Sie anwenden wollen? Prima, dann sollten Sie nun einen Testassay einrichten.
Welche Komponenten sollte Ihr Testassay beinhalten?
Da die qPCR Mastermixe verschiedener Hersteller verschiedene Zusammensetzungen haben und die Zusammensetzung eines Mastermixes einen großen Einfluss auf die PCR hat, sollte bei jedem neuen PCR-Ansatz und bei jedem Wechsel eines PCR Mastermixes ein Testassay durchgeführt werden.
Ein Testassay zeigt Ihnen sehr schnell, ob Anpassungen in Ihrem Protokoll notwendig sind. Ein optimaler Testassay sollte die folgenden Komponenten beinhalten:
- No-Template-Kontrolle (NTC), um mögliche Kreuzkontaminationen zu erkennen. Statt eines Templates wird nur Wasser verwendet.
- Template-Serienverdünnungen mit mindestens 5 Verdünnungsschritten, um die optimale Template-Menge zu bestimmen. Darüber hinaus sollten Sie zum Testen Gene mit bekanntem und sowohl niedrigem als auch hohem Expressionslevel (z.B. Housekeeping Gene) verwenden. So können Sie später testen, welche cDNA-Menge für Ihr Assay optimal funktioniert. Um die Effekte von Pipettierfehlern zu minimieren, sollten Sie zudem mindestens Triplikate Ihrer Proben ansetzen.
- Verschiedene Primerkonzentrationen zum Testen der qPCR-Spezifität, um Primer-Dimere zu verhindern.
- NoRT-Kontrolle (noRT), wenn Sie als Template eine reverse Transkription (RT) aus mRNA verwenden. Als Kontrolle sollten Sie hier ein Sample ohne RT-Enzym verwenden.
Sie haben mithilfe des Testassays notwendige Anpassungen an Ihrem Protokoll durchgeführt und Ihr qPCR-Assay nun erfolgreich gestartet? Dann sollten Sie im Anschluss auch eine Qualitätsvalidierung durchführen.
Wie Sie die Qualität Ihres qPCR-Assays bestimmen
Schmelzkurvenanalyse
In qPCR-Assays mit interkalierenden Farbstoffen wie SYBR-Green oder Genaxxons Green DNA dye ist eine Qualitätskontrolle der Spezifität durch eine Schmelzkurvenanalyse am Ende des qPCR-Laufs unerlässlich. Dieser Prozess erfolgt mittels kontinuierlicher Temperaturerhöhung und gleichzeitiger Fluoreszenzmessung durch den qPCR-Cycler. Da mit zunehmender Temperatur die vorhandenen doppelsträngingen DNA-Produkte denaturieren, wird ein abnehmendes Fluoreszenzsignal detektiert. Wird die Änderung der Steigung dieser Kurve letztlich als Funktion der Temperatur dargestellt, erhält man eine Schmelzkurve.
Ein spezifisches qPCR-Ergebnis zeigt nur einen klaren Schmelzpeak. Das Vorhandensein mehrerer Peaks deutet auf Primer-Dimere oder unspezifische PCR-Produkte hin, was eine Anpassung des qPCR-Assays erfordert, um die Spezifität zu verbessern.
Beachten Sie, dass die Schmelztemperatur an sich von der Länge und Sequenz des Amplikons sowie der Salzkonzentration des verwendeten Puffers im Mastermix abhängig ist. Ein Wechsel des Mastermixes kann zu einer Verschiebung der Schmelztemperatur führen, aber niemals zu einem Doppelpeak. Mehrere Peaks deuten stets auf eine geringe Spezifität der qPCR hin.
Ct-Wert
Für eine umfassende Bewertung der Assay-Performance spielen die Ct-Werte eine entscheidende Rolle, unabhängig von der angewandten Methode. In beiden qPCR-Verfahren werden die Daten in einem Amplifikationsdiagramm visualisiert, wobei die Anzahl der thermischen Zyklen auf der x-Achse und die detektierten Fluoreszenzsignale auf der y-Achse abgebildet sind.
Der Ct-Wert (Threshold Cycle) der qPCR wird anhand einer solchen Fluoreszenzkurve bestimmt. Dabei wird die maximale Änderung der zweiten Ableitung der Fluoreszenzkurve bestimmt - d. h. der Punkt, an dem die Fluoreszenzänderung nicht mehr ansteigt - und somit die exponentielle Amplifikation beendet ist. Der Zyklus, in dem dies der Fall ist, wird als "Quantifizierungszyklus (Cq)" bezeichnet – dies entspricht dem Ct-Wert, der direkt von der Menge an cDNA abhängig ist – je höher der cDNA-Input, desto niedriger der Ct-Wert.
Bitte beachten Sie, dass die Berechnung des Ct oder Cq-Wertes auch mit anderen Methoden durchgeführt werden kann. Es ist wichtig, dass Sie immer die gleiche Methode für Ihr Experiment verwenden. Auch sollten Sie beachten, dass selbst geringfügige Pipettierfehler zu variierenden Ct-Werten führen können. Daher empfiehlt es sich, mindestens drei Wiederholungen einer Probe zu analysieren.
Wie Sie Ihre qPCR-Spezifität optimieren
- Primerkonzentration: Die Primerkonzentration spielt eine entscheidende Rolle in der qPCR-Reaktion und sollte entsprechend angepasst werden. Im Allgemeinen gilt: Eine niedrigere Primerkonzentration minimiert das Risiko der Bildung von Primer-Dimeren.
- Amplikonlänge: Die Länge des Amplikons ist entscheidend für die Robustheit, Sensitivität und Spezifität eines qPCR-Assays. Dies gilt insbesondere für sondenbasierte qPCR (z.B. Taqman-Assays). Assays mit interkalierenden Farbstoffen sind weniger empfindlich gegenüber der Amplikonlänge.
- Annealingtemperatur: Allgemein gilt, je höher die Annealingtemperatur, desto spezifischer die Reaktion. Das Annealing wird typischerweise bei 60°C durchgeführt, und die verwendeten Primer sollten eine Schmelztemperatur > 60°C haben.
Fazit
Die Optimierung Ihrer qPCR-Assays erfordert Geduld und Sorgfalt. Die oben genannten Schritte und Tipps können Ihnen jedoch dabei helfen, genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und sicherzustellen, dass Ihr qPCR-Assay optimiert ist. Sie haben weitere Fragen oder brauchen Unterstützung bei Ihrer qPCR? Dann fragen Sie uns gerne direkt: info@genaxxon.com
