28. Oktober 2024
N. Tröndle
Science SNP, Annealing, Annealingtemperatur, Aptamer
Science SNP, Annealing, Annealingtemperatur, Aptamer
Optimierung der SNP-Analyse mit aptamerbasiert inhibierten DNA-Polymerasen: Wichtige Tipps für eine erfolgreiche PCR
Genaxxon bietet speziell aptamer-inhibierte DNA-Polymerasen an, die sich ideal für die SNP-Analyse eignen. Diese hochselektiven Enzyme sind gezielt für hochselektive PCR-Tests und Mutationsnachweise modifiziert – perfekt, wenn Sie „die Nadel im Heuhaufen" finden möchten.
Was sind Aptamere?
Aptamere sind kurze, einzelsträngige Oligonukleotide, die für die Erkennung und Bindung an spezifische Zielmoleküle, wie Proteine oder kleine Moleküle, entwickelt wurden (https://de.wikipedia.org/wiki/Aptamer).
Mithilfe des Verfahrens Systematische Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) werden Aptamere hinsichtlich ihrer Spezifität und Affinität optimiert.
In der PCR bieten Aptamere mehrere Vorteile:
- Niedriges Molekulargewicht
- Einfache Modifizierbarkeit
- Ausgezeichnete Stabilität
Aptamerbasierte Inhibition von DNA-Polymerasen
Bei Genaxxon werden Oligo-Aptamere verwendet, um die Aktivität der SNP-DNA-Polymerasen gezielt zu hemmen. Diese Oligo-Aptamere binden bei niedrigen Temperaturen an das aktive Zentrum der Polymerase und blockieren so ihre Aktivität. Erst bei Temperaturen von deutlich über 54°C lösen sie sich und ermöglichen die Reaktion.
Da Aptamere auch bei höheren Temperaturen nicht denaturieren, binden sie erneut, sobald die Temperatur unter 54°C sinkt. Dies bedeutet, dass die Annealing-Temperatur bei Verwendung unserer SNP-DNA-Polymerasen stets über 55°C liegen muss, um eine effiziente Amplifikation zu gewährleisten. Dies ist auch beim Primer-Design zu beachten.
Optimierung der Annealing-Temperatur
Liegt die Annealing-Temperatur unter 55°C, ist mit einer stark reduzierten oder gar keiner Amplifikation zu rechnen. Besonders bei AT-reichen Sequenzen sollten dann längere Primer eingesetzt werden, um eine stärkere Bindung zu ermöglichen.
Eine zusätzliche Methode zur Erhöhung der Annealing-Temperatur ist die Verwendung von Locked Nucleic Acids (LNA). Diese modifizierten Nukleinsäuren wurden 1997 unabhängig von Jesper Wengel (1) und Takeshi Imanishi (2) beschrieben und sind seither fester Bestandteil hybridisierungsbasierter Anwendungen. Der Einbau einzelner LNA-Basen erhöht die Schmelz- bzw. Annealing-Temperatur eines Primers um etwa 2-3°C pro LNA-Base (3,4). In der SNP-Analyse sollten LNA-Basen bevorzugt im mittleren Bereich des Primers platziert werden, da eine Platzierung an den Enden weniger effektiv ist.
Fazit
Aptamerbasierte Inhibitoren bieten klare Vorteile in der SNP-Analyse, insbesondere durch ihre präzise Kontrolle der Polymerase-Aktivität und ihre hohe Spezifität. Eine optimale PCR-Leistung erfordert jedoch eine ausreichend hohe Annealing-Temperatur. Falls nötig, können LNA-Oligonukleotide verwendet werden, um die Effizienz weiter zu steigern und bestmögliche Ergebnisse zu erzielen.
Literatur
1. LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Koshkin AA, Singh SK, Nielsen P, Rajwanshi VK, Kumar R, Meldgaard M, Olsen CE, Wengel J; Biochemistry (2006), 45 (23), S. 7447–7455; doi:10.1021/bi060307w.
2. Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering. Obika S, Nanbu D, Hari Y, Morio KI, In Y, Ishida T, Imanishi T; Tetrahedron Letters (1997), 38 (50), S. 8735–8738; doi:10.1016/S0040-4039(97)10322-7.
3. Structures, dynamics, and stabilities of fully modified locked nucleic acid (β-D-LNA and α-L-LNA) duplexes in comparison to pure DNA and RNA duplexes. Suresh G, Priyakumar UD; J Phys Chem B. (2013), 117(18):5556-64. doi: 10.1021/jp4016068.
4. Biological Activity and Biotechnological Aspects of Locked Nucleid Acids. Lundin KE, Højland T, Hansen BR, Persson R, Bramsen JB, Kjems J, Koch T, Wengel J, Smith CI; Adv Genet. (2013), 82:47-107. doi: 10.1016/B978-0-12-407676-1.00002-0
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