PCR - Verschiedenes

Uracil-DNA Glycosylase (UDG) auch Uracil N-Glycosylase (UNG) genannt, katalysiert die Freisetzung von Uracil aus Uracil-enthaltender DNA. Die UDG/UNG von Genaxxon ist ein hochreines, rekombinantes Enzym, isoliert aus E.coli mit der Masse von 26 kDa. UDG hydrolysiert effizient einzel- und doppelsträngige DNA, die Uracil enthält, außer bei Oligomeren mit 6 oder weniger Basen. Daher wird Uracil-DNA Glycosylase (UDG) überall dort eingesetzt, wo man das Risiko von DNA-Verschleppung (Kontaminationen) bei der PCR vermeiden muss. Damit die UDG/UNG die DNA auch hydrolysieren kann, benötigen Sie dUTP > in Ihren PCR Reaktionen. Aufbewahrungspuffer: 20mM Tris  HCl (pH 8,0) 50mM NaCl 0,1mM EDTA 50% Glycerin Reaktionspuffer (1X): 20 mM Tris HCl (pH 8,0) 1 mM EDTA

Reines, qualitätsgeprüftes, nukleasefreies Wasser eignet sich für alle Experimente, die nukleasefreies Wasser benötigen, einschließlich molekularbiologischer Anwendungen, z. Bsp. PCR. Nukleasefreies Wasser wird speziell prozessiert, um DNase, RNase freies, deionisiertes Wasser zu erhalten. Verunreinigungen mit Nukleasen kann zu inkonsistenten bis hin zu komplett fehl geschlagenen Experimenten führen. Genaxxon bietet daher verschiedene Nuklease-freie Wasserqualitäten an: steriles, Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser (M6082 >) und Nuklease-freies Wasser (nicht DEPC-behandelt) (M6340 >). Unser Nuklease-freies Wasser wird in nukleasefreien PE-Behältern, oder in Glasflaschen abgefüllt.

Steriles, destilliertes Wasser, das frei von DNasen, RNasen und Proteinasen ist. Zusätzlich wurde das Wasser mit DEPC behandelt, um ganz sicher zu gehen, dass keine Spuren an RNase vorhanden sind. Aus diesem Grund ist dieses Wasser speziell für RT-PCR oder andere molekularbiologische Anwendungen geeignet, bei denen RNasen zu 100% entfernt sein müssen. Genaxxon bietet daher verschiedene Nuklease-freie Wasserqualitäten an: steriles, Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser (M6082 >) und Nuklease-freies Wasser (nicht DEPC-behandelt) (M6340 >). Unser Nuklease-freies Wasser wird in nukleasefreien PE-Behältern, oder in Glasflaschen abgefüllt.

Oligo(dT)20 Primer sind für die Synthese von cDNA mithilfe einer reversen Transkriptase, z. B. der MMuLV (M3042) > geeignet. Der Primer hybridisiert an den poly(A)-Schwanz der mRNA. Er wird am 5´-Ende phosphoryliert, um das Klonieren der cDNA zu erleichtern. Oligo (dT) 20-Primer wurden entwickelt, um die Synthese von cDNA aus Gesamt-RNA in einer reversen Transkriptionsreaktion zu initiieren, wobei die Reverse Transkriptase die Reaktion vom Poly-A-Ende der mRNA startet. Oligo(dT)20 Primer können auch zur Herstellung markierter cDNA zum Screening von Mikroarrays verwendet werden. Die garantierte Liefermenge von 5OD entspricht ca. 27,2nmol, bzw. 163,7µg. Die Primer sind qualitätsgeprüft (MS), gereinigt (reversed phase HPLC), lyophilisiert und aliquotiert. Die 5 OD können in 271,5µL DEPC-Wasser gelöst werden und ergeben dann eine Konzentration von 100pmol/μL (100μM), bzw. 600ng/µL. 272µL (100µM / 600ng/µL) ergeben zwischen 325 und bis zu 645 reverse Transkriptionsreaktionen von 20µL (250ng bis 500ng Oligo (dT)20 pro 1µg RNA in 20µL Reaktionsvolumen). Eine Mischung (1:1 Ratio) von random Hexamerprimern (M3038) > und Oligo(dT)-Primer kann die Sensitivität der cDNA-Synthese erhöhen, indem speziell die Synthese von längeren cDNA-Stücken verstärkt wird. Applikationen: cDNA Synthese aus Gesamt-RNA mittels reverser Transkription. optimal zur Erstellung von cDNA-Banken aus eukaryotischer mRNA geeignet. Full length cDNA Klonierung 3’ rapid amplification of cDNA ends (3’ RACE) Herstellung markierter cDNA zum screening von Microarrays.

Random Hexamere sind kurze Oligodeoxyribonukleotide der zufälligen Sequenz [d(N)6]. Die Primer sind qualitätskontrolliert (MS), gereinigt (HPLC), lyophilisiert und zu einer garantierten Menge von 5OD (ca. 76,1nmol (136,4µg)) aliquotiert. Hexanukleotid-Primer bestehen aus einer Mischung von zufälligen 5'-Hydroxylhexanukleotiden oder Hexameren. Die Primer binden an zufällig komplementäre Bereiche auf einer Ziel-DNA oder -RNA und dienen dann als Primer für die DNA-Synthese mittels einer DNA Polymerase oder Reversen Transkriptase zur reversen Transkription. Die heterogene Natur der Random Primer stellt sicher, dass alle theoretisch möglichen Sequenzen im gelieferten Produkt enthalten sind. Dadurch sind diese Primer gut dazu geeignet, ein möglichst langes (vollständiges) Transkript der RNA zu erstellen, bzw. vor allem bei langen RNA-Templates auch die 5'-Enden zu transkripieren. Als Alternative können auch Oligo(dT)-Primer > für die reverse Transkription benutzt werden. Diese binden an den polyA-Schwanz von RNA, womit die Transkription auf jeden Fall immer am 3'-Ende der RNA beginnt. Die garantierte Liefermenge von 5OD, entsprechend ca. 76,1nmol, bzw. 136,4µg, können in 760µL DEPC-Wasser gelöst werden und ergeben dann eine Konzentration von 100pmol/μL (100μM), bzw. ca. 180µg/µL. Wenn man zwischen 50ng und 250ng der Hexamere pro 20µL RT-Reaktion einsetzt, reichen 760μL (100μM) für 460 bis 2280 reverse Transkriptase Reaktionen.

SafeGel red stain ist ein äußert sensitiver Fluoreszenzfarbstoff zum Färben von Nukleinsäuren, der das toxische, keimbahnmutagene Ethidiumbromid (EtBr) zum Färben von dsDNA, ssDNA oder RNA in Agarose- oder Polyacrylamidgelen ersetzt. SafeGel red stain ist viel empfindlicher als EtBr, ohne dass ein Entfärbeschritt benötigt wird. SafeGel red stain ist weniger toxisch und weniger mutagen als EtBr wobei beide praktisch dasselbe UV-Spektrum zeigen, so dass man EtBr direkt ersetzen kann, ohne existierende Imagingsysteme ersetzen zu müssen. SafeGel red stain kann dazu benutzt werden, dsDNA, ssDNA oder RNA mittels pre-staining oder post-staining in Agarosegelen > zu färben. PAGE-Gele können nur mit dem post-staining Verfahren angefärbt werden. SafeGel red stain stört auch eine weitergehende Verarbeitung der DNA, wie Restriktionverdaus, Southernblots oder Klonierungen nicht. Die Ergebnisse des Ames-Tests bestätigen, dass der Farbstoff für Latexhandschuhe und Zellmembranen undurchdringlich ist. Bei Verwendung der empfohlenen Arbeitskonzentrationen bei der Gelfärbung ist der rote Gelfarbstoff nachweislich nicht in der Lage, Zellmembranen zu durchdringen, und er ist bei Arbeitskonzentrationen nicht zytotoxisch und nicht mutagen. Eine Serie von Sicherheitstests hat gezeigt, dass SafeGel red stain bei Verwendung der empfohlenen Arbeitskonzentrationen hinaus nicht giftig, nicht mutagen und nicht gefährlich ist. Als ein Resultat daraus kann der Fluoreszenzfarbstoff mit dem normalen Abfall entsorgt werden und spart damit neben dem separaten Handling des EtBr-Abfalls auch noch merklich an Entsorgungskosten. Der Fluoreszenzfarbstoff SafeGel red stain wird als 10,000X Lösung in Wasser geliefert. Diese Lösung kann direkt zum post-staining eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn der Farbstoff direkt mit der DNA in den Gelslot pipettiert wird. Lesen Sie auch in unserem Blogbeitrag, warum Sie jetzt Genaxxons SafeGel testen sollten. Für erstklassige Agarosegele bieten wir unsere Standard Agarose LE >, oder auch unsere Spezialagarosen mit hoher Auflösung Tiny (M3046) > oder Tiny HT (M3047) > an. * * *Discover our NEW Product: More Info PDF >

Green DNA Dye ist ein sensitiver Fluoreszenzfarbstoff für die Detektion von dsDNA in der Real-time PCR (qPCR) oder für DNA Gele (Agarose oder Polyacrylamid). Da unser Green DNA Dye eine wesentlich höhere Affinität zu dsDNA hat, ist dieser Farbstoff besonders geeignet, wenn neben der zu detektierenden dsDNA noch RNA oder ssDNA vorliegen. Mit einer außergewöhnlich niedrigen Hintergrundfluoreszenz ist der Green DNA Dye ideal für die Anwendung mit Laserscannern geeignet. Außerdem ist Green DNA Dye viel sensitiver als Silberfärbung bei der Detektion von doppelsträngiger DNA in nativen Polyacrylamidgelen. Wenn sich der grüne Fluoreszenzfarbstoff ungebunden in Lösung befindet, emittiert er nur ein sehr schwaches Fluroeszenzsignal. Sobald der Green DNA Dye aber an dsDNA gebunden ist, verstärkt sich das Signal (ca. 1000-fach!), was das Fluoreszenzsignal direkt proportional zur Menge der amplifizierten dsDNA macht. Der Genaxxon Green DNA Dye wird als 100-fach Lösung in DMSO geliefert. Die Konzentration des Farbstoffs wird traditionell als Verdünnungsfaktor angegeben, wobei die 1-fach Verdünnung verwendet wird, um DNA in Gelen zu färben. Für PCR-Reaktionen sollte man mit einer 0,2-fachen Lösung beginnen, um zu optimieren und die richtige Konzentration zu ermitteln. Unsere Kunden vertrauen auf Genaxxons Green DNA Dye und nutzen den Farbstoff u.a. bei der Erforschung der Regulation von Tomur-Suppressorgenen oder der Impfungen und der Krankheitsbilder ausgelöst durch Infektionen mit Enteroviren. Herstellung einer 10-fach Arbeitslösung für die realtime PCR: Green DNA Dye eignet sich für realtime PCR in einer Endkonzentration von 0,2X (kurze Target von 50-400bp). Verdünnen Sie die 100-fache Stammlösung 1:10 mit Nuklease-freiem Wasser (Vorverdünnung) und geben Sie von dieser Lösung 0,4µL zu einer 20μL PCR-Reaktion (20µL Endvolumen). Die 10-fach Arbeitslösung muss bei -20°C gelagert und spätestens alle 2-3 Wochen erneuert werden. Green DNA dye ist ein ungefährlicher (nicht cancerogener) Fluoreszenzfarbstoff zum Anfärben von Nukleinsäuren als Alternative zu Ethidiumbromid. Sie suchen weitere nicht-toxische Farbstoffe für Ihre Gel-Elekrophorese? Dann probieren Sie doch auch SafeGel red stain oder SafeGel green stain - die kostengünstige Alternativen zu EtBr.. Für Ihre qPCR erhalten Sie bei Genaxxon auch verschiedene qPCR Mastermixe > für Ihre jeweiligen Anforderungen mit oder ohne ROX >.Hier geht es zum Formular für Ihr qPCR Mastermix Testmuster >

ROX wird als passiver Referenzfarbstoff verwendet, um Unterschiede in der Fluoreszenz zwischen den Wells auszugleichen, die nichts mit der PCR zu tun haben, also zur Normalisierung des fluoreszierenden Reportersignals in quantitativer Realtime PCR (qPCR) oder RT-PCR. Unterschiede in der Fluoreszenz können z.B. auftreten aufgrund von Variationen in der Lichtintensität zwischen den Wells, die von der optischen Konstruktion der PCR-Maschine herrühren, oder durch Pipettierunterschiede. Die ROX Fluoreszenz ändert sich nicht im Verlauf der PCR-Reaktion, stellt aber eine stabile Basislinie dar, auf die die Proben genormt sind. Anregung und Emission des Referenzfarbstoffs liegen bei 584nm und 612nm. Die Konzentration, die verwendet wird, hängt ab vom Realtime qPCR-Instrument oder, genauer gesagt, von dem verwendeten Filter. Bei älteren Realtime qPCR-Maschinen gibt es noch keine exakt für die ROX Fluoreszenz passenden Filter. Daher werden bei diesen Maschinen hohe Konzentrationen an ROX benötigt. Einige neuere Maschinen brauchen keinerlei internen Standard, um Unterschiede in der Lichtintensität auszugleichen. Dennoch könnte ein interner Standard nützlich sein, um Variationen beim Pipettieren zu korrigieren. Dieser Referenzfarbstoff ist qualifiziert für die Verwendung auf Instrumenten wie ABI PRISM® 7700, One-Step System, RotorGene und vielen anderen. Bitte beachten Sie die Bedienungsanleitung der jeweiligen qPCR-Maschine im Hinblick auf die adäquate Menge an ROX. Ready-to-use qPCR Mastermixe mit hoher Konzentration an ROX (High ROX, 500nM), niedriger Konzentration Low ROX (50nM) oder ohne ROX stehen Ihnen bei Genaxxon zur Verfügung (qPCR >).

B-Enhancer Lösung kann verwendet, werden um Multiplex-PCR Ergebnisse oder die PCR von GC-reichen Templates zu verbessern. Die Stammlösung ist 5M. Die Arbeitskonzentration beträgt 1M. Die Ergebnisse zeigen, dass die Genaxxon bioscience B-Enhancer Lösung mit der Q-solution von Qiagen vergleichbar ist. Bei Einsatz der B-Enhancer Lösung sollte die Annealingtemperatur verringert werden. Es kommt vor, dass für ein gegebenes Primerpaar eine Annealingtemperatur von 55°C verwendet werden muss, wenn normalerweise eine Annealingtemperatur von 60-65°C eingesetzt wird. Die optimale Annealingtemperatur sollte für jede Reaktion separat ermittelt werden. 500µL für 100 x 50µL PCR Reaktionen.

Der Ladepuffer I Fluoro ist vergleichbar mit dem Ladepuffer M3308, enthält zusätzlich aber einen fluoreszierenden Farbstoff, der bei Blaulicht oder UV-Beleuchtung von Agarosegelen eine sofortige Visualisierung der DNA-Banden bewirkt. Ladepuffer I Fluoro wird als 6-fach DNA-Ladepuffer geliefert und dient zur Vorbereitung von DNA-Markern oder PCR-Proben für das Laden auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gele. Ladepuffer I Fluoro ist das empfindlichste Färbereagenz für den Nachweis doppelsträngiger DNA (dsDNA). Der Ladepuffer enthält die drei Tracking-Farbstoffe Bromphenolblau, Xylencyanol FF und Orange G zur visuellen Verfolgung der DNA-Migration während der Elektrophorese, sowie einen Fluoreszenzfarbstoff zur Detektion der DNA-Banden ohne zusätzliche Färbung des Gels. Daher ist unser Ladepuffer I Fluoro eine ideale Alternative zu Ethidiumbromid (EtBr). Ungefähre Anregungs- und Emissionswellenlängen: 300, 495 / 537 nm, gebunden an Nukleinsäure. Für mehr Informationen zu unseren SimplyEnlight PCR-Produkten lesen Sie jetzt unseren Blogbeitrag. Genaxxon's SimplyEnlight PCR - Unlock the Power of Your PCR! Bild 1: Vergleich UV- und Blaulichtanregung                              Bild 2: Auswirkung von EtBr plus UV auf die Clonierungseffizienz

Der DNA Ladepuffer I ist ein 6-fach Ladepuffer für die Applikation der PCR-Reaktion auf ein Agarosegel. Der Puffer enthält Glycerin, EDTA, Bromophenolblau und Xylenecyanol. 6X Ladepuffer für die DNA Applikation in Gele. Der Genaxxon 6X DNA Loading Dye wird benutzt um DNA Marker und DNA-proben für das Auftragen auf Agarose- oder Polyacrylamidgele vorzubereiten. Der Puffer enthält zwei unterschiedliche Farbstoffe (Bromophenolblau und Xylencyanol FF) um die DNA-Migration während der Elektrophorese zu visualisieren.

DNA Ladepuffer II mit Orange G ist ein spezieller Ladepuffer um DNA-Banden bis unterhalb 65 bp im Gel sichtbar bleiben zu lassen. Der 6-fach Puffer enthält Glycerin, EDTA und Orange G. Orange G läuft unterhalb 50 bp im Gel und ist zusätzlich durchlässiger für Fluoreszenz als Bromophenolblau oder Xylencyanol.

Coral Red Buffer ist ein 10-fach Pufferzusatz zum Anfärben des PCR-Puffers for der PCR-Reaktion. Die Lösung enthält Glycerin, EDTA, einen roten und einen gelben Farbstoff. 5µL von diesem Pufferzusatz werden zu 45µL des PCR-Ansatzes vor der PCR-Reaktion gegeben, um diese rot einzufärben. Als Alternative bietet Genaxxon bioscience den ready-to-use RedMastermix M3029 > an. Dieser PCR Mastermix enthält alle für die PCR notwendigen Bestandteile inklusive eines roten Farbstoffes, der die visuelle Kontrolle von Pipettierschritten ermöglicht.

5X PCR Buffer Red ist ein ready-to-use PCR Puffer der alle Bestandteile für die Standard PCR enthält. Eigenschaften:ready-to-use Puffer für höchsten KomfortDirekte Beladung von Agarosegelen möglichDer rote Farbstoff ermöglicht die visuelle Kontrolle der PipettierschritteDie Farbbande läuft bei ca. 1000 - 2000 bp bei 0,5% bis 1,5% Agarosegele BeschreibungDer 5X PCR Buffer Red bietet die gleiche Spezifikation wie  unser Taq-E PCR Puffer mit Ammoniunsulfat. Er führt zu einer hohen Ausbeute an PCR-Produkten und minimiert die Notwendigkeit zur Optimierung der Mg2+ - Konzentrationen oder der Annealingtemperaturen. Der enthaltene Farbstoff macht die Beladung des Agarosegels nach der PCR einfach und ohne zeitaufwendige Probenvorbereitung möglich.  Beachten Sie auch unsere dNTP-Sets (100mM je dNTP) > oder dNTP-Mixe mit 2 mM > oder 10 mM > Konzentration oder unsere modifizierten Nukleotide, wie z. B. Biotin-11-dUTP >. Für Ihre erfolgreiche PCR finden Sie hier unsere Taq DNA Polymerse (M3001) >, unsere Proof-Reading Polymerasen Pfu (M3004) >, Pwo (M3002) > oder ReproFast (M3003) >, sowie unseren ready-to-use RedMastermix (M3029) >, der schon dNTPs enthält.