Fast-PCR: Zusammenspiel von Geräten, Plastikware, Reagenzien und Methodik

Fast-PCR: Das Zusammenspiel von Geräten, Plastikware, Reagenzien und Methodik

Die Standard-PCR-Amplifikation erforderte früher oft eine aufwendige DNA-Extraktion, Reinigung, Verarbeitung und Probenaufbereitung. Dabei wurden aus heutiger Sicht noch relativ primitive Geräte und komplexe Protokolle verwendet. Die Vorstellung, dass 35 PCR-Amplifikationszyklen in weniger als 25 Minuten abgeschlossen werden könnten, ohne die Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu beeinträchtigen, wurde als Zukunftsvision angesehen.
Die schnelle, gleichzeitige Entwicklung von Geräten, Plastikartikeln, Reagenzien und Methoden ermöglicht es heutzutage, ein aussagefähiges PCR-Ergebnis innerhalb von einer Stunde zu erhalten. Diese sogenannte "Fast PCR" ist jedoch abhängig von der Optimierung aller Parameter, um reproduzierbare, genaue und effiziente Ergebnisse zu erzielen.

1. Geräte: Thermocycler
Alle Thermocycler amplifizieren DNA. Viele Geräte können darüber hinaus für andere Anwendungen wie DNA-Klonierung, Sequenzierung und Gentests verwendet werden1. Mehrere gerätespezifische Faktoren, einschließlich der aktuellen Ramping Rate, der Messung der Probentemperatur und der genauen Berechnung von "Overshoots" durch den Thermocycler, tragen zur Integrität und Leistungsfähigkeit von PCR-Assays bei2.

Der Magnetic Induction Cycler (MIC), entwickelt von Bio Molecular Systems, ist eines der fortschrittlichsten Instrumente, die bis heute entwickelt wurden. Im Gegensatz zum Peltier-Block-basierten System bietet der MIC-Cycler kurze Zykluszeiten (< 25 Minuten) und eine überlegene Temperaturgleichförmigkeit (± 0.05C) und verzichtet auf die Notwendigkeit einer thermischen Isolierung, da der Rotor die einzige Komponente ist, die erhitzt wird3. Bei Verwendung von Realtime  Mastermixen, wie sie von Genaxxon bioscience entwickelt wurden, ist es möglich, kurze Amplikons mit 35 Zyklen in weniger als 25 Minuten zu generieren. Die MIC-Technologie erfordert keine Referenz-Fluoreszenzfarbstoffe. Daher sind der GreenMastermix (2X) > und der ProbeMastermix (2X) > von Genaxxon bioscience ideal für den MIC qPCR-Cycler geeignet. Mastermixe von Genaxxon enthalten alle notwendigen Komponenten für schnelle, zuverlässige und quantifizierbare qPCR-Ergebnisse.


Graph 1: Data provided by Genaxxon bioscience GmbH

Weitere Fortschritte der Geräteentwicklung:
- Steilere Ramping Rates aufgrund besserer Heiz- und Kühlmethoden (Peltier-Elemente statt Wasserkühlung).
- Verbesserter Temperaturübergang vom Cycler-Block zu PCR-Röhrchen als Ergebnis einer ausgereifteren Produktentwicklung; oder durch Verwendung von Materialien wie Silber- oder Goldblöcken, die einen effizienten Temperaturübergang ermöglichen. Solche Verbesserungen wurden im Laufe der Zeit von den Herstellern von Thermocyclern eingeführt. Die ersten Instrumente von Perkin Elmer (TC-1 und TC-2) beispielsweise hatten Anstiegsraten im Bereich von 1-2 Minuten. Der Cycler der nächsten Generation (GeneAmp 9600) verkürzte diese Zeit auf 30 Sekunden.

Die folgende Tabelle zeigt, wie die Technologie von Thermocyclern in den letzten 30 Jahren die Effektivität vor allem in Hinblick auf die Zykluszeiten verbessert hat:

Typisches PCR-Protokoll für TC-1 Thermocycler von Perkin Elmer in den 80ern:
1. Denaturierung: 94°C 1 Minute
2. Annealing: 55°C 2 Minuten
3. Extension: 72°C 2 Minuten 30 Sekunden, 35 Zyklen

Typisches PCR-Protokoll für GeneAmp 9600 Thermocycler von Perkin Elmer in den 90ern:
1. Denaturierung: 94°C 30 Sekunden
2. Annealing: 55°C 30 Sekunden
3. Extension: 72°C 1 Minute 30 Sekunden, 35 Zyklen

Typisches PCR-Protokoll für PCR Thermocycler in den 2010ern:
1.  Denaturierung: 94°C 15 Sekunden
2. Annealing: 55°C 15 Sekunden
3. Extension: 72°C 30 Sekunden, 35 Zyklen

MIC PCR protocol mit Genaxxon bioscience Mastermixen - 2018:
1.    Denaturierung: 95°C 5 Sekunden
2.    Annealing / Extension 60°C 5 Sekunden, 25 Zyklen


Einfaches Beschleunigen der Ramping Rate und des Protokolls reichen unter Umständen nicht aus, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Blockkonformität und Optimierung des Zusammenspiels Gerät/PCR-Reagenzien sind ebenfalls sensible Faktoren.
 “A key component of overall protocol run time is the time to reach target temperature, which is determined by the average ramp rate and the time for the sample block to reach thermal uniformity,” (Hilary Srere, Marketing Manager for amplification in the Gene Expression Division at Bio-Rad Laboratories). Dieser Parameter war in erster Linie wichtig bei der Entwicklung der MIC-Technologie, die alle Probleme beseitigt hat, die mit der Steigungsrate und der positionsabhängigen Temperaturvariabilität verbunden sind.

2. Plastikware
Nicht alle Kunststoffe sind gleich. PCR-Gefäße und Platten mit dünneren Wänden (z. B. dünnwandige PCR-Gefäße von Genaxxon >) ermöglichen einen viel schnelleren Temperaturübergang vom Heizblock zum PCR-Reaktionsgemisch. Wir empfehlen jedoch, verschiedene Plastikwaren parallel zu screenen, um die relativen Effizienzen zu bestimmen, mit denen die Block- und die Probentemperaturen ausgeglichen werden. Andere Überlegungen umfassen: das Reaktionsvolumen und die Zusammensetzung und ob die Wärmeübertragung vom Block über die Plastikware zu den Proben positionsabhängig ist.

3. Reagenzien
Viele Wissenschaftler zögern, bewährte Reagenzien durch ungeprüfte Alternativen zu ersetzen, die schnellere und genauere Ergebnisse versprechen. Andere weigern sich zu wechseln aufgrund der hohen Kosten, die mit der QS-Prüfung verbunden sind, oder sie halten sich zurück aus Besorgnis,  vertraute durch unbekannte Marken zu ersetzen, in zum Beispiel einigen analytischen Laboren in staatlichem bzw. Privatbesitz.
Diese Zurückhaltung wird noch verstärkt durch die Erkenntnis, dass einige schnell arbeitende PCR-Kits mit langen oder schwierigen Amplikons nicht gut arbeiten.
Alle technischen Verbesserungen bei den Instrumenten und Verbrauchsmaterialien machten DNA-Polymerasen notwendig, die in der Lage sind, schnelle Temperaturänderungen zu bewältigen. Da Wildtyp-Enzyme die Gefahr eines Misserfolgs oder einer schlechten Leistung erhöhen können, bieten immer mehr Anbieter von Realtime PCR-Mastermixen Kits an mit modifizierten DNA-Polymerasen, die für sehr kurze Zykluszeiten zumindest für kleine Amplikons geeignet sind im Bereich von bis zu 300 bp, ohne die Leistung oder Genauigkeit zu reduzieren.

4. Methodik
Seit ihrer Einführung in den 1980er Jahren hat sich die PCR-Technologie soweit entwickelt, dass die Zykluszeiten zunehmend reduziert wurden, die Spezifität und Genauigkeit der Zielvorgaben erheblich verbessert und die Risiken von falschem Priming und falsch positiven / negativen Daten signifikant gesenkt wurden.
Dennoch kann die Kinetik der PCR-Reaktion zu schlechten PCR-Ergebnissen führen, wenn schnell arbeitende PCR-Reagenzien in Verbindung mit den neueren schnellen Thermocyclern verwendet werden. PCR und insbesondere qPCR sind fehleranfällig, wenn die Zyklusparameter nicht optimiert sind und die Reaktion zu schnell abläuft. Dies stellt eine Herausforderung dar für die Bestimmung, welches Protokoll für einen spezifischen Test an einem bestimmten Instrument am besten geeignet ist.
Obwohl die Fast-PCR klare Vorteile bietet, selbst mit schnell arbeitenden PCR-Reagenzien, die keinen speziellen Thermocycler erfordern, widerstehen viele Forscher immer noch der Möglichkeit, eine neue Methode zu erproben, trotz der Zusicherung beträchtlicher Zeitersparnis und verbesserter Genauigkeit.

Wie können also die Zykluszeiten weiter verkürzt werden, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen? Einige gängige Strategien umfassen:
-    Protokolländerungen, die bei den meisten Schritten Zeit ersparen: Nach Etablierung einer PCR wird es sehr oft möglich sein, die Dauer von einzelnen PCR-Schritten in einem optimierten PCR-Protokoll zu reduzieren.
-    Kombination von Annealing und Extension, wodurch mindestens 2 Temperatursteigerungs-/senkungsschritte gespart werden. 2-Schritt-PCR-Protokolle sind inzwischen sehr gebräuchlich und werden erfolgreich eingesetzt.
-    Multiplex PCR: Durchführung der PCR mit verschiedenen Amplicons in einer PCR.
-    Reduzierung von reverser Transkription und Amplifikation zu einem einstufigen Verfahren: Die Entwicklung des Genaxxon Bioscience HotScriptase Kits ermöglicht die RT-PCR ohne einen isothermalen RNA-Transkriptionsschritt.
-    - In einigen Thermocyclern unterscheidet sich die Ramping-Geschwindigkeit für "langsame" und "schnelle" PCR-Programme. Trey Foskett, Mitbegründer von Kapa Biosystems, empfiehlt die schnelle Ramping-Geschwindigkeit, da es ein wenig Zeit spart, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen.

5. Trouble shooting
Sie sollten immer Ihren eigenen PCR-Mix und das Programm optimieren, wobei Sie zuerst die Empfehlungen der Hersteller berücksichtigen sollten, bevor Sie entscheiden, ob Sie deren Vorschlägen folgen oder diese abändern.
Bei einigen Thermocyclern unterscheidet sich die Ramping-Geschwindigkeit für "langsame" und "schnelle" PCR-Programme. Wechseln Sie nicht zwischen den beiden Möglichkeiten für ein bestimmtes PCR-Protokoll.
Eine große Herausforderung bei der Entwicklung der Fast-PCR besteht darin, zu bestimmen, welche Anwendungen für die Umwandlung in schnelle PCR-Assays am geeignetsten sind. Oft neigen schnelle PCR-Protokolle dazu, einen oder mehrere der für eine effiziente Amplifikation notwendigen Reaktionsparameter zu beeinträchtigen. Zum Beispiel kann eine unzureichende DNA-Denaturierung oder ein nicht optimales Primer-Annealing dramatische Auswirkungen auf die PCR-Effizienz haben, was zu Reaktionsmisserfolgen für Tests führt, die bereits grenzwertig arbeiten.

Während die durch Fast-PCR versprochenen Vorteile verlockend sind, sind die Kosten für die neue Technologie für einige Forscher unerschwinglich.

6. Fast-PCR mit kleinem Budget
Norbert Tröndle, CEO von Genaxxon bioscience, geht davon aus, dass die Akzeptanzraten von Fast-PCR wahrscheinlich zunehmen werden, dass sie aber aus den oben genannten Gründen für einige Zeit mit aktuellen Technologien koexistieren werden. Ungeachtet ihres Formats werden PCR-Technologien immer ihren Ursprung in den Grundlagen der reversen Transkription und Amplifikation von Nukleinsäuren haben.
Auch ohne hochmoderne Instrumente ist es immer noch möglich, Ihre Forschung mit neuen Enzymen und/oder Reagenzienmischungen zu beschleunigen, wie die folgenden Strategien zeigen:
-    - Verwenden Sie den MIC-Cycler zusammen mit den etablierten Realtime PCR-Reagenzien > von Genaxxon.
-    Testen Sie den HotScriptase RT-PCR-Kit > von Genaxxon bioscience, der ein verbessertes und schnelleres Protokoll für die RT-PCR bietet und die Notwendigkeit eines isothermalen RNA-Transkriptionsschritts umgeht.
-    Beschleunigen Sie den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) mithilfe von Genaxxons SNP Pol DNA-Polymerase >. Dieses Enzym amplifiziert DNA nur, wenn das 3'-Ende des Primers und die Ziel-DNA-Sequenz perfekt übereinstimmen.
-    Amplifizieren Sie DNA direkt aus Lebensmitteln tierischen Ursprungs, indem Sie Genaxxons kürzlich etablierten IdentityTaq 2X-Mastermix > verwenden. Da vorherige DNA-Isolierung und DNA-Reinigung nicht erforderlich sind, spart diese Methode viel Zeit. Das Gesamtresultat ist beeindruckend: Nach einem kurzen Lyseschritt sind Ihre Endergebnisse in weniger als einer Stunde inklusive Gelelektrophorese fertig! Der IdentityTaq 2X-Master-Mix kann mit Kontroll-DNA und Primerpaaren für DNA-Sequenzen aus frischen oder zubereiteten Lebensmitteln mit Rind, Schwein, Lamm, Geflügel, Truthahn, Pferd, Katze, Hund, Maus, Ratte, Lachs, Forelle oder Kabeljau bestellt werden sowie für Lebensmittel, die für den menschlichen oder tierischen Verzehr zubereitet werden, wie Hamburger, Hotdogs, Dönerspieße, Lasagne, Tierfutter oder andere Produkte.
Nehmen Sie sich die Zeit - es ist möglich, Ihre Forschung mit neuen Enzymen und / oder Reagenzienmischungen zu beschleunigen.

6. Referenzen
1. „Thermal cyclers: behind the technology“(https://www.labcompare.com/10-Featured-Articles/140609-Thermal-Cyclers-Behind-the-Technology/)
2.  „Thermal cyclers: key thermal cycling concepts and ramp rates“(https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/PCR/pdfs/Thermal-Cycler-Ramp-Rates-AppNote.pdf)
3. „What is the difference between Peltier Block-based and Magnetic Induction technology?“  (https://biomolecularsystems.com/mic-qpcr/learn/)

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