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30. März 2020
Science
RNA-Extraktion zu Nachweis und Analyse von viraler RNA für die real-time RT-PCR - Vergleich verschiedener Extraktionsverfahren
Die Extraktion und Isolation viraler RNA ist der erste und entscheidende Schritt, um Virus-RNA mittels real-time RT-PCR nachzuweisen. In diesem Artikel präsentieren wir bewährte Methoden für eine erfolgreiche Extraktion viraler RNA.
Für die Analyse von Virusinfektionen sind laut dem Robert-Koch-Institut Nested RT-PCR und real-time RT-PCR etablierte Verfahren. Im Vergleich zu ELISA oder IFA können diese Methoden bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Infektion durchgeführt werden. Damit die real-time RT-PCR genaue Ergebnisse liefert, muss die Virus-RNA zunächst effizient isoliert werden.
Zu den gängigen Methoden der RNA-Extraktion gehören:
- Reinigungskits und Säulchen
- Single-Step-Methode nach Chomczynski und Sacchi
- Klassische Phenol-Chloroform-Methode
Obwohl alle genannten Methoden grundsätzlich sehr effizient sind, gibt es ein gemeinsames Problem: den verbleibenden Gehalt an genomischer DNA nach der RNA-Extraktion. Diese DNA-Kontamination kann insbesondere bei nachfolgenden Anwendungen wie der RT-PCR zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Um dies zu vermeiden, sollte die genomische DNA durch DNase I oder Phenol-Chloroform-Extraktion entfernt werden. Zusätzlich kann der Einsatz eines RNase-Inhibitors verhindern, dass die RNA während des Prozesses abgebaut wird.
Extraktion viraler RNA mit kommerziellen Reinigungskits
Die Extraktion viraler RNA mithilfe von kommerziellen Reinigungskits basiert auf dem Prinzip der "spin column-based nucleic acid purification". Dieser Ansatz verwendet einen Lysepuffer, um die Zellen aufzubereiten und das Homogenat auf spezielle Reinigungssäulchen aufzutragen. Die chaotropen Salze im Lysepuffer inaktivieren dabei vorhandene RNasen.
Der Total RNA Purification Kit – Tissue von Genaxxon ermöglicht die Extraktion von hochwertiger RNA aus Geweben (auch erhältlich für Blutproben/Zellkultur). Dieser Kit ist speziell für die Isolierung von RNA geeignet. Er verwendet Mini Spin Säulchen mit Membranen, die effizient und selektiv Nukleinsäuren bei hoher Konzentration an chaotropen Salzen binden. RNasen werden durch Guanidinthiocyanat und β-Mercaptoethanol inaktiviert.
Zur weiteren Verbesserung der Homogenisierung können keramische Beads verwendet werden, die separat erhältlich sind.
Zusätzlich bietet Genaxxon RNA Mini Spin Reinigungssäulchen für RNA-Reinigungskits anderer Anbieter an.
2. RNA-Extraktion nach der Single-Step-Methode (nach Chomczynski und Sacchi) mit GENAzol
Die Single-Step-Methode nach Chomczynski und Sacchi ist eine Erweiterung der Zwei-Phasen-Methode und nutzt GENAzol, ein Reagenz, das Guanidiniumthiocyanat und Phenol enthält.
Guanidiniumthiocyanat wirkt denaturierend, lysiert die Zellen und inhibiert RNasen, wodurch die RNA stabil bleibt. Im organischen Phenol lösen sich Proteine und DNA, während die RNA im wässrigen Teil verbleibt.
Nach der Homogenisierung der Probe mit GENAzol wird Chloroform hinzugefügt. Dies führt zur Phasentrennung des Homogenats in drei Schichten: eine klare, wässrige obere Schicht, die RNA enthält; eine Grenzschicht; und eine organische untere Schicht, die DNA und Proteine umfasst.
Die RNA wird durch Zugabe von Isopropanol aus der wässrigen Schicht gefällt, gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich für nachfolgende Anwendungen resuspendiert.
3. Selbst hergestellte Zelllyse- und Extraktionspufferlösungen
Aufgrund von Lieferengpässen bei kommerziell erhältlichen RNA-Isolationskits und deren Bestandteilen können selbst hergestellte Pufferlösungen eine praktikable Alternative für Labore darstellen. Studien zeigen, dass diese selbst hergestellten Lösungen in Kombination mit herkömmlichen Reinigungskits vergleichbare Ergebnisse bei der qRT-PCR liefern können.
Eine Untersuchung der Friedrich-Schiller-Universität Jena (S. Deinhardt-Emmer, U.S. Schubert et al.) hat einfach herzustellende Pufferlösungen untersucht, die für die Nukleinsäureextraktion aus respiratorischem Material von SARS-CoV-2-positiven Patienten verwendet wurden:
a. Pufferlösungen basierend auf der denaturierenden und chaotropen Substanz Guanidiniumthiocyanat:
- Pufferlösung mit 2-Mercaptoethanol: Diese Lösung enthält 2-Mercaptoethanol, das aufgrund seiner Toxizität für Menschen und Gewässer besondere Sicherheitsmaßnahmen erfordert, einschließlich Schutzkleidung und Arbeiten unter einem Abzug.
- Pufferlösung ohne 2-Mercaptoethanol: Diese Alternative enthält kein toxisches 2-Mercaptoethanol, weist jedoch einen etwas höheren Cq-Wert auf. Das enthaltene Octylphenol-Derivat Triton X-100 wird jedoch aufgrund seiner endokrinen Wirkung auf die Umwelt als besonders besorgniserregender Stoff eingestuft.
b. Guanidiniumthiocyanat-freie Pufferlösungen:
Diese Pufferlösungen haben eine geringere Effizienz im Vergleich zu solchen mit Guanidiniumthiocyanat. Wenn das potente Guanidinium-Salz nicht verfügbar ist, können diese Alternativen verwendet werden:
- Pufferlösung mit Triton X: Triton X-100 ist aufgrund seiner endokrinen Wirkung auf die Umwelt als besonders besorgniserregender Stoff eingestuft.
- SDS-Lysispuffer: Ein Protokoll für die folgende real-time RT-PCR wurde von der Charité in Berlin bereitgestellt, die laut WHO als Referenzlabor für die Untersuchung auf SARS-CoV-2-Viren anerkannt ist. Das Protokoll finden Sie hier: WHO-Protokoll.
Von der RNA-Isolation zur Amplifikation: Effiziente Lösungen für die RT-PCR
Nach einer erfolgreichen RNA-Extraktion folgt die Reverse Transkription und Amplifikation der viralen RNA in einem entscheidenden Schritt: der RT-PCR. Dieser Schritt ist ausschlaggebend für die genaue Detektion und Quantifizierung der Ziel-RNA. Um diesen Prozess zu optimieren, bietet Genaxxon zwei spezialisierte Produkte, die sowohl die Effizienz als auch die Genauigkeit des Verfahrens erhöhen.
Der HotScriptase RT Mastermix von Genaxxon bietet eine einzigartige Lösung für die gleichzeitige Reverse Transkription und DNA-Amplifikation in einem einzigen Schritt. Durch die Kombination von Reverser Transkriptase und DNA-Polymerase in einem Enzym entfällt der übliche isothermale Zwischenschritt, was sowohl Zeit als auch Kosten spart.
Für anspruchsvollere Anwendungen, wie die Synthese von längeren cDNAs (bis zu 17 kb) oder GC-reichen Ziel-RNAs, bietet das Scriptase RT - cDNA Synthesekit von Genaxxon eine hervorragende Lösung. Diese proprietäre Reverse Transkriptase zeichnet sich durch eine verminderte RNase-H-Aktivität und erhöhte Thermostabilität aus, was sie ideal für Anwendungen wie RNA-seq, Genexpressionsanalysen und die Diagnostik macht. Mit Oligo(dT)- und Random Hexamer Primern im Lieferumfang ist der Scriptase RT-cDNA Synthesekit flexibel anpassbar und garantiert eine hohe Sensitivität bei der cDNA-Synthese.
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