Die Extraktion und Isolation viraler RNA ist der erste Schritt zum Nachweis und Test von Virus-RNA über real-time RT-PCR. Wir stellen hier verschiedene Methoden und Protokolle zur Extraktion viraler RNA vor.
Nested RT-PCR und real-time-Verfahren (real-time RT-PCR) sind die gängigen Methoden zur Analyse von Virusinfektionen (s. Robert-Koch-Institut >). Im Gegensatz zu Untersuchungen mit ELISA oder IFA können diese zu einem früheren Zeitpunkt einer Infektion erfolgen.
Zum Nachweis der Viren-RNA muss diese zunächst isoliert werden, um eine nachgeschaltete Analyse mittels real-time RT-PCR zu ermöglichen. Es gibt verschiedene gängige Methoden: RNA-Extraktion mit Reinigungskits und Säulchen, die Single-Step-Methode nach Chomczynski und Sacchi oder die klassische Phenol-Chloroform-Methode. Ein allen Methoden gemeinsames Problem, neben den toxischen Bestandteilen, ist der Restgehalt an genomischer DNA nach der RNA-Extraktion. Diese Kontamination ist von Bedeutung für nachgeschaltete Anwendungen wie die RT-PCR, da noch vorhandene DNA zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Die DNA kann z.B. mit DNase I > -Aufschluss oder mit Phenol-Chloroformextraktion eliminiert werden. Ein Abbau der RNA kann mit einem RNase Inhibitor > verhindert werden.
Eine Übersicht zu den in den hier vorgestellten Methoden finden Sie in unserem Online-Katalog unter RNA-Tools >.
1. Extraktion viraler RNA mit kommerziell erhältlichen Reinigungskits
Das Prinzip der Reinigungskits > ("spin column-based nucleic acid purification") basiert auf einem Lysepuffer zur Aufbereitung der Zellen und dem Auftragen des Homogenats auf spezielle Reinigungssäulchen >. Chaotrope Salze im Lysepuffer inaktivieren dabei vorhandene RNasen.
Der Viral RNA und DNA Purification Kit von Genaxxon > besitzt eine fortschrittliche Kieselgelmembrantechnologie zur schnellen Isolierung intakter RNA/DNA innerhalb von 30 Minuten. Der Kit ist geeignet für die Extraktion von RNA aus Plasma, Serum, Urin, Zellkulturüberstand, zellfreier Flüssigkeit oder virusinfiziertem Gewebe wie Nasen-oder Rachenabstrichen.
Das Protokoll dazu finden Sie hier >.
Der Total RNA Purification Mini Spin Kit > von Genaxxon ermöglicht die Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus Gewebe und Zellen. Dieser Kit ist ebenfalls für die Isolierung aus RNA geeignet. Der Kit verwendet Säulchen mit Membranen, die effizient und selektiv Nukleinsäuren bei hoher Konzentration an chaotropen Salzen binden. Jegliche RNasen werden mit Guanidinthiocyanat und β-Mercaptoethanol inaktiviert. Der Kit enthält ein neuartiges Antifoam Reagenz >, das Schaumbildung verhindert.
Der Total RNA Purification Mini Spin Kit PLUS > enthält darüber hinaus zusätzliche Homogenisierungs-Tubes mit keramischen Beads zur Zerkleinerung von Zellen. Die keramischen Beads > sind auch separat erhältlich.
Reingung in 96-well Platten mit Membranen - Hochdurchsatzscreening
Der 96-well Plate Total RNA Purification Kit > von Genaxxon ist optimal für das Hochdurchsatzscreening geeignet. Der Kit verwendet 96-well Platten mit Membranen, die in Gegenwart hoher Konzentrationen an chaotropen Salzen sehr effizient und selektiv Nukleinsäuren binden. Das Homogenat wird mit Guanidinthiocyanat und Detergenzien lysiert. Jegliche RNasen werden durch Guanidinthiocyanat und β-Mercaptoethanol inaktiviert. Durch Zugabe von Ethanol wird RNA auf der Membran der 96-well Platte gebunden.
Bei Genaxxon erhalten Sie RNA Mini Spin Reinigungssäulchen > für RNA-Reinigungskits auch anderer Anbieter.
2. RT-PCR direkt aus ganzen Zellen ohne RNA-Reinigung oder Zelllyse
Der Genaxxon HotScriptase RT Cell Mastermix > ermöglicht die RT-PCR direkt aus ganzen Zellen ohne zeitaufwendige und teure RNA-Reinigung oder Zelllyse. Die Amplifikation erfolgt direkt aus den Zellen. Der Cell RT Mastermix mit der HotScriptase RT Polymerase > ermöglicht die RT-PCR direkt aus der Zellsuspension ohne isothermalen reversen Transkriptase- Zwischenschritt. So lassen sich z.B. RNA-Vireninfektionen ohne vorherige Isolation oder Reinigung von RNA direkt aus verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Speichel oder aus Spermaflüssigkeit mittels RT-PCR nachweisen.
3. Extraktion von RNA nach der Single-Step-Methode (nach Chomczynski und Sacchi >), als Erweiterung der Zwei-Phasen-Methode
Mit GENAzol >, das Guanidiniumthiocyanat und Phenol enthält. Guanidiniumthiocyanat wirkt denaturierend, lysiert also Zellen und inhibiert RNasen. Im organischen Phenol lösen sich vorhandene Proteine und DNA.
Der mit GENAzol homogenisierten Probe wird Chloroform hinzugegeben. Das Homogenat trennt sich daraufhin in eine klare wässrige obere Schicht (die RNA enthält), eine Grenzschicht und eine organische untere Schicht (mit DNA und Proteinen). RNA wird aus der wässrigen Schicht mit Isopropanol gefällt. Die ausgefällte RNA wird gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und anschließend für den Einsatz in Folgeanwendungen resuspendiert.
4. Selbst hergestellte Zelllyse- und Extraktionspufferlösungen
Aufgrund von Lieferengpässen kommerziell erhältlicher RNA-Isolationskits und derer Bestandteile kann dies eine echte Alternative für Labore sein. Die Verwendung der Lösungen mit Säulchen herkömmlicher Reinigungskits führten in der nachfolgenden qRT-PCR zu vergleichbaren Detektionen.
Dazu hat die Friedrich-Schiller-Universität Jena (S. Deinhardt-Emmer, U.S. Schubert et al >) eine Untersuchung über einfach herzustellende Pufferlösungen veröffentlicht, die für die Nukleinsäureextraktion aus respiratorischem Material von positiv getesteten SARS-CoV-2 PatientInnen verwendet wurden.
a. Pufferlösungen basierend auf der denaturierenden und chaotrophen Substanz Guanidiniumthiocyanat:
- Pufferlösung mit 2-Mercaptoethanol: Aufgrund der bestehenden Toxizität von 2-Mercaptoethanol für den Menschen und für Gewässer ist die Verwendung von Schutzkleidung sowie das Arbeiten unter einem Abzug erforderlich.
- Pufferlösung ohne 2-Mercaptoethanol:
Das toxische 2-Mercaptoethanol ist hier nicht enthalten. Diese Pufferlösung besitzt aber einen etwas geringeren Cq-Wert als diejenige mit 2-Mercaptoethanol laut der Studie.
Das enthaltene Octylphenol-Derivat Triton X-100 wird laut Umweltbundesamt aufgrund seiner endokrinen Wirkung auf die Umwelt jedoch als besonders besorgniserregender Stoff eingestuft.
b. Guanidiniumthiocyanat-freie Pufferlösungen
Diese besitzen eine geringere Effizienz. Sofern das potente Guanidinium-Salz nicht verfügbar ist, kann auf diese Pufferlösungen zurückgegriffen werden.
- Pufferlösung mit Triton X: Triton X-100 wird laut Umweltbundesamt aufgrund seiner endokrinen Wirkung auf die Umwelt jedoch als besonders besorgniserregender Stoff eingestuft.
- SDS-Lysispuffer
Ein Protokoll für die folgende real-time RT-PCR wurde von der Charité in Berlin, das laut WHO als Referenzlabor für die Untersuchung auf SARS-CoV-2-Viren ausgewiesen ist, zur Verfügung gestellt:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2
