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Überprüfung und Kontrolle von Indels mit SNP Pol DNA-Polymerase

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Datum: November 2, 2018 12:00

Nachweis und Kontrolle von Indels mit SNP Pol DNA-Polymerase

Indels (Indel ist ein Kunstwort aus Insertion und Deletion) beschreiben Mutationen, die durch Deletion oder Insertion von Nukleotiden entstanden sind. Daraus resultieren z.B. Polymorphismen: Bei einigen Individuen wurde eine Sequenz von Nukleotiden hinzugefügt oder entfernt, wodurch an dieser Stelle ein Polymorphismus in der Population entstanden ist. Indels unter 50 bp Länge werden auch als Microindels, große Insertionen und Deletionen über 1 kb als CNVs (copy number variations) bezeichnet. Sie treten vor allem als Short Tandem Repeats auf. Indels werden zum Beispiel bei der Bestimmung von pflanzlichen Chloroplasten herangezogen1. Hier konnte festgestellt werden, dass Insertionen von mehr oder weniger repetitiven Aminosäuresequenzmotiven mit positiver Selektion einhergehen.

Indelmutationen kommen häufig im Genom vor. Sie bilden nach SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) die zweithäufigste Art von genetischen Variationen im Genom und sind oft mit verschiedenen Erkrankungen assoziiert2. Dabei kommt es auf den Genlokus des Indels, also ob sich die Mutation in einer Protein-kodierenden Region befindet oder nicht, sowie auf die Anzahl der Nukleotide an, die hinzugefügt oder entfernt wurden. Handelt es sich um ein komplettes Triplett, sind die Auswirkungen meist weniger gravierend als wenn es sich um ein oder zwei (bzw. die Vielzahl davon, die nicht durch drei teilbar ist) Basen handelt. In diesem Fall kommt es zu einer Frameshift-Mutation mit Auswirkungen auf die Translation aller folgenden Aminosäuren.

Mit Genaxxons SNP Pol DNA-Polymerase können bekannte Indels einfach und kostengünstig überprüft werden. Dazu wird der Primer so etabliert, dass eines der Nukleotide, die den Beginn des Indels kennzeichnen, am 3´-Ende des Primers zu liegen kommt. Die SNP Pol DNA Polymerase amplifiziert nur Primer, die am 3’-Ende 100%ig passen und unterscheidet diese von falsch gepaarten Primern. Wenn die zum 3'-Ende des Primers komplementäre Base auf dem DNA-Strang die Mutation zeigt und der Primer nicht, dann erfolgt keinerlei Amplifikation. Sie haben somit eine schnelle Gewissheit zu 100%.

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Die Genaxxon SNP Pol DNA-Polymerase ist eine hochselektive DNA-Polymerase, die für die allelspezifische Diskriminierung entwickelt wurde. Sie identifiziert Einzelnukleotidpolymorphismen, unter anderem bei CRISPR/Cas9-gesetzten Punktmutationen oder beim Erkennen falscher CRISPR/Cas9-Produkte bzw. Indels. Genaxxons SNP Pol Polymerase erkennt Mismatches und produziert nur dann ein spezifisches Amplicon, wenn das Primer-Template-Paar perfekt zusammenpasst.

Der Nachweis von Indels findet immer häufiger durch eine der inzwischen zahlreichen Varianten des Next-Generation-Sequencings (NGS) statt. Gründe sind die gesteigerte Effizienz, die niedrigeren Kosten sowie eine Verbesserung der Sensitivität durch die verschiedenen Sequenzierungsplattformen und Analysetools. Auch hier gibt es aber immer noch viele Fehlerquellen und die Unterscheidung von Indel oder Fehlern beim NGS bleibt schwierig. Als hilfreiche Ergänzung kann hier die SNP Pol DNA-Polymerase dienen zur Kontrolle bzw. Bestätigung.

1. P. Erixon und B. Oxelman: Whole-Gene Positive Selection, Elevated Synonymous Substitution Rates, Duplication, and Indel Evolution of the Chloroplast clpP1 Gene. PLoS ONE. (2008) 3(1): S. e1386 PMID 18167545

2 Mullaney JM1, Mills RE, Pittard WS, Devine SE: Small insertions and deletions (INDELs) in human genomes.
Hum Mol Genet. 2010 Oct 15;19(R2):R131-6. doi: 10.1093/hmg/ddq400. Epub 2010 Sep 21.
PMID: 20858594