Plant DNA Q-Extraction Solution

Die ungiftige Plant DNA Q-Extraction-Lösung ermöglicht eine schnelle und einfache Extraktion von Nukleinsäuren aus verschiedenem Pflanzenmaterial (z. B. Efeu oder Brennnessel). Die PCR-fähige Nukleinsäure wird einfach in einem 1,5mL Reaktionsgefäß mit 100µL der Plant DNA Q-Extraktionslösung versetzt und in nur 8 Minuten extrahiert.

Die einstufige Lyse wird entweder in einem Thermocycler oder einem Heizblock durchgeführt und ist in zwei einfache Heizschritte unterteilt. Die extrahierte DNA ist dann ohne weitere Behandlung wie Vortexen, Zentrifugieren oder Verdünnen für die PCR bereit. Der erhaltene DNA-Extrakt ist bei -20°C bis zu einer Woche und bei -80°C für die Langzeitlagerung stabil.

Für optimale Genotypisierungsergebnisse empfehlen wir die Verwendung unseres InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X). Für schnelle Direct-PCR von Pflanzenproben bieten wir auch das komplette InhibiCore Rapid Plant DNA Q-Extraction PCR Kit an. 

Eigenschaften:

• One-Reagent-Setup
• Minimales Handling
• Schnelles 8-Minuten-Protokoll
• PCR-fertige DNA
• Kein Proben- oder Ausbeuteverlust
• DNA-Extraktion aus Pflanzenmaterial
• Ungiftige Reagenzien
• Skalierbares Setup
• Automatisierungsfreundlich

Extraktionsprotokoll
Die Präparation von DNA sollte in einem von der PCR getrennten Raum (Areal) erfolgen.

1. Auftauen der Plant DNA Q-Extraction Solution.
Beim ersten Mal sollte die Plant DNA Q-Extraction Lösung gut gemischt und in kleinere Aliquots pipettiert werden, um die Anzahl der Einfrier- und Auftauzyklen pro Aliquot zu minimieren (Die Plant DNA Q-Extraction Solution ist eine milchig erscheinende Lösung).
2. Platzieren Sie die Pflanzenprobe in einem 1,5mL Reaktionsgefäß, das mit 100µL Plant DNA Q-Extraction Solution befüllt ist. Die von uns empfohlene Probenmenge finden Sie in der Tabelle des Datenblatts.
3. Das geschlossene Reaktionsgefäß, das die Pflanzenprobe und die DNA Extraktionslösung enthält, für 15 Sekunden vortexen. Bitte darauf achten, dass das gesamte Pflanzenmaterial mit Plant DNA Q-Extraction Solution bedeckt ist.
4. Platzieren Sie das Reaktionsgefäß in einem Thermoblock oder einem Thermocycler und inkubieren Sie bei 

1. 65 °C für 6 min
2. 98 °C für 2 min
3. 4 °C (oder Abkühlen auf Eis).

Der DNA-Extrakt ist nun fertig für die PCR / realtime PCR. 
Bitte beachten Sie: Das Pflanzen-DNA-Lysat sollte vor der PCR 5- bis 10-fach verdünnt werden. Wir empfehlen die Durchführung einer seriellen Verdünnung.

Anwendungsbeispiele:

1. Sensitive qPCR-Analyse von Chlorophyll-Genen aus Weizenlysaten

Die zuverlässige und sensitive Detektion von Chlorophyll-Gen-Targets aus Pflanzenlysaten wurde mittels qPCR unter Verwendung des InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X) (M3250) gezeigt. Dabei wurde eine Verdünnungsreihe von Weizenlysat (10 % bis 0,001 %) eingesetzt, um Sensitivität und Inhibitortoleranz zu evaluieren.

Trotz hoher Lysatkonzentrationen konnte in allen Verdünnungen eine erfolgreiche Amplifikation nachgewiesen werden, was die hohe Robustheit gegenüber pflanzlichen Inhibitoren bestätigt. Eine einzelne, spezifische Schmelzkurve ohne unspezifische Produkte unterstreicht die hohe Assay-Spezifität. Die Proben wurden mit dem schnellen 8-Minuten-Protokoll der Plant DNA Q-Extraction Solution vorbereitet - eine effiziente DNA-Gewinnung ohne klassische Aufreinigungsschritte.

Abbildung 1: qPCR-Daten aus Weizenlysat mit dem InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X)
Die Abbildung zeigt Amplifikationskurven sowie eine Schmelzkurvenanalyse einer Verdünnungsreihe von Weizenlysat (10 % bis 0,001 %) und einer No-Template-Kontrolle (NTC), durchgeführt mit dem InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X) und 1x GreenDye.
Im FAM-Kanal ist eine klare, konzentrationsabhängige Amplifikation zu erkennen, wobei bei 10 % Lysat eine reduzierte Signalintensität aufgrund von Matrixeffekten auftritt. Die Schmelzkurvenanalyse zeigt für alle positiven Proben einen einzelnen, spezifischen Peak, was eine spezifische Zielamplifikation ohne unspezifische Produkte bestätigt.

2. Benchmark der Direct-PCR-Leistung aus 10 % Tomatenlysat

Die Performance des InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X) (M3250) wurde im Vergleich zu drei konkurrierenden Mastermixen für die qPCR aus 10 % Tomatenlysat getestet. Die Proben wurden mit der Plant DNA Q-Extraction Solution vorbereitet und mittels Fluoreszenzdetektion im FAM-Kanal analysiert.
Der InhibiCore Master Mix zeigte eine erfolgreiche Amplifikation mit früher Ct-Detektion und damit die höchste Effizienz sowie beste Inhibitortoleranz im Vergleich zu den getesteten Konkurrenzprodukten. Zwei der Vergleichsmischungen zeigten ebenfalls Amplifikation, während zwei Systeme keine signifikanten Signale aufgrund starker Inhibition lieferten. Die Spezifität der Amplifikation wurde durch eine einzelne, klare Schmelzkurve ohne unspezifische Produkte bestätigt.


Abbildung 2: Direct-PCR aus Pflanzenproben – Benchmark der Inhibitorwirkung in Tomatenlysat

Die Direct-PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 °C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s, anschließend Schmelzkurvenanalyse.
Der InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X) sowie Competitor N zeigten erfolgreiche Amplifikation, während Competitor T und Competitor Q stark inhibiert waren und keine zuverlässigen Amplifikationskurven lieferten. Der InhibiCore Rapid Plant PCR MasterMix (5X) zeigte den frühesten Ct-Wert aller getesteten Systeme und damit die höchste Toleranz gegenüber pflanzlichen PCR-Inhibitoren sowie die beste Performance.

3. Easy Handling der Proben

Plant DNA Q-Extraction Solution wurde zur Extraktion genomischer DNA aus verschiedenen Pflanzengeweben verwendet. Für die DNA-Extraktion wurde jeweils 10mg Blattgewebe zu 100µL Plant DNA Q-Extraction Solution hinzugefügt.

Abbildung 3: DNA-Extrakte aus Brennnessel und Efeu
PCR-Tubes in Doppelansätzen mit 100 µL Plant DNA Q Extraction Solution und 10 mg Blattmaterial von entweder Brennessel oder Efeu. A: Brennnessel und B: Efeu vor der Extraktion mit der Plant DNA Q Extraction Solution. C: Brennnessel und D: Efeu nach der Extraktion mit der Plant DNA Q Extraction Solution.

Abbildung 4: Amplifikation von aus Efeu extrahierter DNA
Die aus Efeu extrahierte DNA wurde unter Verwendung von zwei Primerpaaren amplifiziert, die folgende Zielsequenzen nachweisen: A) genomische Pflanzen DNA (ITS, 335 bp) und B) Chloroplasten-DNA (trnL, 380 bp). Als Positivkontrolle dienten 1 ng/Reaktion DNA aus Brennnessel, aufgereinigt mit dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Zusätzlich sind Doppelansätze von Proben enthalten, die ohne Lysepuffer (ohne Lyse-Reagenzien) unter Verwendung des Plant DNA Q-Extraction Solution-Protokolls („No treatment“) extrahiert wurden. Alle DNA-Extrakte wurden in Doppelbestimmung amplifiziert.