Proofreading Polymerasen und Mastermixe

Proofreading Polymerasen und Mastermixe - schnell und fehlerfrei ans Ziel mit GENAXXONs neuer Generation, High Fidelity proofreading DNA-Polymerasen, die eine hohe Amplifikationsrate gepaart mit einer sehr hohen Genauigkeit bieten

High Fidelity proofreading DNA-Polymerasen, die eine hohe Amplifikationsrate gepaart mit einer sehr hohen Genauigkeit bieten und die auch für schwierige Templates geeignet sind, bilden die Basis für erfolgreiche Klonierungen, Sequenzierungen, NGS-Anwendungen, SNP-Analysen oder Mutagenesen. Für diese Herausforderungen bietet Genaxxon mit dem

AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase MasterMix 2X

genau das, was Sie benötigen.

Sie sind interessiert, welche herausragenden Eigenschaften Ihnen dieses Produkt, insbesondere die Polymerase,
für Ihre Fragestellungen bieten - dann lesen Sie weiter!

Welche Aufgaben erfüllen Polymerasen

Um Ihnen eine zeitliche Einordnung zu geben: im Jahr 1956 wurde von Arthur Kornberg die erste Polymerase (DNA-Polymerase I aus E.coli) entdeckt und isoliert. Erst 15 Jahre später gelang die Isolierung der DNA-Polymerasen II und III aus E.coli.

Die Hauptaufgabe einer Polymerase ist die chemische Verknüpfung einzelne Moleküle (Monomere) zu einer Kette (Polymer). Bei einer DNA-Polymerase werden aus Desoxy-Nukleosidtriphosphaten (dNTPs) als Monomere die Desoxyribonukleinsäure (DNS) als Polymer gebildet. Dabei nutzt die DNA-abhängige DNA-Polymerase einen bereits bestehenden DNA-Einzelstrang als Matrize für die Synthese eines neuen, komplementären Stranges.

Das korrekte Kopieren der Vorlage erfolgt vom 5´- zum 3´-Ende durch die komplementäre Basenpaarung (vermittelt durch Wasserstoffbrücken) der eingebauten Nukleotide mit den Basen der Matrize. Chemisch betrachtet findet dabei ein nukleophiler Angriff der endständigen 3'-Hydroxygruppe des DNA-Stranges auf das α-Phosphat des dNTPs statt, wobei Pyrophosphat freigesetzt wird.

Bei DNA-Polymerasen erfolgt die Synthese des komplementären DNA-Stranges nur, wenn ein freies 3´-Hydroxyende zur Verfügung steht. Bei der Polymerase Kettenreaktion (PCR) werden hierzu etwa 20 Nukleotide lange DNA-Einzelstränge (Primer) verwendet, die als Startpunkt der Reaktion dienen. Als Kofaktor benötigen DNA-Polymerasen in der Regel Magnesium Ionen.

Verwendung von Polymerasen im Labor

Ein Meilenstein der Molekularbiologie war die Entdeckung und Isolierung der thermostabilen DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien oder Archaeenarten. Das bekannteste Enzym hierbei ist die Taq Polymerase, die 1969 erstmals von Thomas Brock und Hudson Freeze isoliert wurde. Erst die Verwendung dieser thermostabilen DNA-Polymerasen ermöglichte eine Automatisierung der PCR im Labor.

Die zu den A-Typ-DNA-Polymerasen gehörenden bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen (zB Taq Polymerase) besitzen neben der 5´-3´-Polymerase-Aktivität eine 5´-3´ Exonuklease-Aktivität und erzeugen am 3'-Ende des neu erzeugten Stranges einen Adenosin-Überhang. Der so entstandene A-Überhang, kann für sogenannte TA-Klonierungen verwendet werden.

Die Prozessivität, die die durchschnittliche Anzahl an Basenpaaren beschreibt, bevor eine Polymerase vom Template abfällt, liegt bei der Taq Polymerase bei etwa 200 Basenpaaren. Die Extension rate der Taq-Polymerase liegt bei etwa 2 kb/min und die Standard Amplikonlänge liegt bei etwa 7 kb.

Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine 3´-5´ Exonukleaseaktivität und damit keine proofreading Funktion. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt etwa 8x10−6 Fehler pro Basenpaar, weshalb sich in den amplifizierten DNA-Fragmenten häufig Mutationen finden, die durch ungenaues Kopieren des Matrizenstranges entstehen.

Aber wer möchte schon Fehler in seiner amplifizierten DNA!

Hier hat die Natur zum Glück durch die sogenannten proofreading Polymerasen vorgesorgt. Die aus Archaeen stammenden DNA-Polymerasen gehören zum B-Typ (z.B. Pfu, Pwo und ReproHot-Polymerase), die keine 5´-3´-Exonuklease-Aktivität besitzen und im Gegensatz zur Taq Polymerase am 3´-Ende keinen Überhang erzeugen. Die daraus resultierenden blunt-ends können direkt für blunt-end Klonierungen genutzt werden.

Stattdessen besitzen diese DNA-Polymerasen neben der 5´-3´-Polymerase-Aktivität eine 3´ -5´ Exonuklease-Aktivität - eine Aktivität, die zur Korrektur von Synthesefehlern (proofreading) befähigt. Diese Korrekturlesefunktion sorgt dafür, dass der neu synthetisierte DNA-Strang fortlaufend auf Fehlpaarungen überprüft wird. Auftretende Fehlpaarungen werden umgehend mit dem Ausbau des fehlerhaften und dem Einbau des korrekt basenpaarenden Nukleotids korrigiert.

Die proofreading Polymerasen kommen in der Molekularbiologie hauptsächlich bei den PCR Reaktionen zum Einsatz, die sequenzexakte DNA-Amplifikate liefern müssen, wie Klonierungen, Sequenzierungen, SNP Analysen oder NGS Anwendungen.

Einer der bekanntesten Vertreter der proofreading-Polymerasen ist die Pfu Polymerase, die 1991 von Lundberg et al. beschrieben wurde. Die Pfu-Polymerase konnte dabei aus der "rasenden Feuerbeere" (Pyrococcus furiosus) isoliert werden. Der Stamm Pyrococcus furiosus wurde erstmals 1986 aus anaeroben Meeressedimenten in Italien mit einer Temperatur von 90°C bis 100°C isoliert und von Stetter und Fiala beschrieben.

Die Pfu-Polymerase zeigt eine vergleichsweise geringe Extension rate von 700 bp/min und eine Standard Amplikonlänge von etwa 5 kb. Der große Vorteil der Pfu Polymerase gegenüber z.B. der Taq Polymerase ist die 10fach geringere Fehlerrate von 1,3x10^-6 Fehler pro Basenpaar.

Doch wie gelingt die Kombination aus hoher Extension rate und Amplikonlänge gepaart mit einer geringen Fehlerrate?

Ein Ansatz war der Versuch die DNA-Polymerasen des Typs A und B zu mischen, um die Vorteile der einzelnen Enzyme zu kombinieren.
Dabei kommt die hohe Extension rate von zB einer Taq Polymerase zum Tragen, während die proof-reading Funktion
einer Pfu Polymerase für die Fehlerkorrektur sorgt.

Auch hier bietet ihnen Genaxxon mit der ReproFast und der ReproHot Polymerase  kostengünstige und effiziente Polymerasen zum erfolgreichen Arbeiten im Labor. 
In weiteren Versuchen wurde durch gezieltes Proteindesign versucht die Pfu Polymerase  dahingehend zu verändern, dass die Extension rate erhöht wird, während die Fehlerrate auf einem niedrigen Niveau bleibt.

Der große Durchbruch gelang jedoch erst durch die Herstellung sogenannter Fusionsproteine. Wang et al. publizierten 2004 die erfolgreiche kovalente Bindung einer nicht-replikativen DNA-Polymerase an ein sequenzunspezifisches dsDNA-Bindungsprotein namens Sso7d aus der thermophilen Archaea Art Sulfolobus solfataricus.
Dank dieser Sso7d-Domäne konnte die Prozessivität (Verweildauer der Polymerase an der DNA pro Bindeereignis) der "Chimären" Polymerase im Vergleich zu anderen Enzymen dramatisch erhöht werden.
Bei Sso7d handelt es sich um ein kleines Protein (7 kD), das ohne Bevorzugung spezifischer Sequenzen kovalent an dsDNA binden kann. Die Bindung der Sso7d-Domäne an eine DNA-Polymerase ist so gestaltet, dass das Fusionsprotein reibungslos entlang der Matrize gleiten kann. Die kovalente Verknüpfung des Fusionsproteins mit einer Pfu-like proofreading Polymerase bringt keine strukturellen Modifikationen mit sich und stört daher weder die strukturelle Integrität, noch die thermische Stabilität des Enzyms und folglich auch nicht die katalytische Aktivität des Enzyms.

Damit wurde genau das erreicht was man wollte - eine deutliche Verbesserung der Prozessivität ohne die katalytische Aktivität oder thermische Stabilität des Enzyms zu beeinträchtigen.
Ein weiterer Vorteil des Fusionsproteins ist die Möglichkeit zur Amplifikation längerer DNA-Fragmente. Die Erhöhung der Prozessivität durch die Fusion von Sso7d mit der Polymerase erhöht die Amplikonlänge um etwa den Faktor fünf (bis 20 kb). Zudem verhilft die erhöhte Prozessivität dem Fusionsprotein, unterstützt durch spezielle Puffersysteme, zu einer verbesserten Amplifikation schwieriger Templates, wie DNA mit besonderen Sekundärstrukturen, GC-reichen oder Loop-Sequenzen.

Welche Varianten dieser "Alleskönner" Polymerasen werden von Genaxxon angeboten?

Der AQ97 High Fidelity MasterMix 2X- für Forscher, die gerne mit Mastermixen arbeiten

Der AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase MasterMix 2X ist ein gebrauchsfertiger 2x PCR-Mix bestehend aus AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase und einem optimierten Puffersystem, einschließlich dNTPs und Magnesiumchlorid.

Die AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase ist ein neuartiges, korrekturlesendes Fusionsprotein aus DNA-Polymerase mit einer die Prozessivität erhöhenden DNA-Bindungsdomäne. Die DNA-Bindungsdomäne dieser Polymerase gewährleistet eine ausgezeichnete High-Fidelity, Langstreckenkapazität und auch schnelle Amplifikationsergebnisse. Die AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase weist sowohl 5'→3' DNA-Polymerase Aktivität als auch 3'→5' Exonuklease Aktivität auf, die es dieser Polymerase ermöglicht, Basenpaar-Fehlpaarungen zu korrigieren.

Neben einer sehr schnellen und robusten Amplifikation komplexer und langer Targets weist die AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase eine hohe Wiedergabetreue auf (60 fach genauer als Taq Polymerase), die eine genaue Amplifikation gewährleistet. Das Enzym eignet sich gut für PCR-Experimente, die eine Amplifikation mit sehr geringen Fehlerraten erfordern, wie Klonierungen, NGS-Anwendungen, SNP-Analyse und Mutagenese.

Für längere Targets als 11 kb empfehlen wir die Verwendung unserer AQ97 High Fidelity DNA-Polymerase mit einer Fähigkeit zur Amplifikation von DNA-Targets bis zu 18 kb. Für schwierige Amplikons, wie GC-reiche DNA-Proben, solche mit komplexen Sekundärstrukturen oder langen Amplikons, wird die Zugabe von 1 – 2 M Betaine Enhancer Solution empfohlen.

Alle Besonderheiten auf einen Blick:

• High Fidelity proofreading Polymerase
• Extrem hohe Amplifikationsrate (>6 kb pro Minute)
• Fehlerrate 6-fach kleiner als die von Pfu oder Pwo, ca. 50-fach kleiner als Taq-Polymerase
• Für lange PCR-Fragmente (bis zu 20 kb für Plasmid DNA und bis zu 7 kb genomische DNA)
• 5´-3´ Polymerase Aktivität und 3´-5´ Exonuklease Aktivität
• Sehr schnell und robust für schwierige Templates
• Generiert blunt ends