Die Popularität der RT-PCR oder Reversen Transkriptions-PCR ist im Zuge der Coronavirus-Pandemie enorm gewachsen, gleiches gilt für die mRNA-Technologie. Aber diese neuen Helden waren nicht immer so hoch angesehen und wurden einst vernachlässigt.
Was hat sich also geändert? Wie sind sie heute zu einem Begriff geworden?
Lassen Sie uns tief in die Entwicklungsgeschichte dieser Technik eintauchen, ohne die wir Coronaviren und andere tödliche Krankheiten niemals bekämpfen könnten!
Wann wurde die RNA eigentlich entdeckt?
Durch Zoonose-Ereignisse machte die Menschheit mit einigen sehr tödlichen Viren wie Influenza, Ebola, Hepatitis, HIV usw. und dem jüngsten Diskussionsthema, dem Coronavirus, Bekanntschaft. Sie alle haben eines gemeinsam, ihr Genom besteht aus RNA. Die Entdeckung der RNA erfolgte im Jahr 1869 durch Friedrich Miescher, er nannte sie "Nuclein" und die Bezeichnung RNA wurde ihr im 20. Jahrhundert gegeben. mRNA wurde im Jahr 1961 von Brenner, Jacob und Meselson entdeckt und von Jacob und Monod benannt. Auch nach der Entdeckung der mRNA, war die DNA immer noch der Star der Show! Das lag daran, dass die DNA das Erbmaterial in allen Organismen war und die mRNA nur ein Zwischenprodukt des zentralen Dogmas war.
Doch eine bahnbrechende Entdeckung änderte den Lauf der Geschichte.
Die Entdeckung der Reversen Transkriptase!
Im Jahr 1970 entdeckten Howard Temin und David Baltimore gleichzeitig die Reverse Transkriptase aus verschiedenen Viren. Howard Temin entdeckte sie in Virionen des Rous-Sarkom-Virus und Baltimore entdeckte sie im Poliovirus und im Vesikulärem Stomatitis-Virus. Dann führte eine Reihe von Forschungen an der Reversen Transkriptase zur Aufklärung des Mechanismus der Retrovirus-Replikation. Einige dieser Forschungsergebnisse lieferten unschätzbare Erkenntnisse, wie die Entdeckung von Retrotransposons und anderen transponierbaren Elementen, die Entdeckung von Ribosomen, die Etablierung des genetischen Codes (Codons), Mechanismen und Muster von Wirtsinfektionen, etc.
Diese fortlaufenden Entdeckungen führten zu einer Änderung des zentralen Dogmas. Es wurde festgestellt, dass die DNA nicht die einzige Form des Genoms ist die Organismen haben, sondern dass auch RNA mit im Spiel ist. All diese Ereignisse zusammen mit der Epidemie des HIV- AIDS-Virus Mitte bis Ende der 1970er Jahre, dessen Genom, Sie haben es richtig erraten, nicht aus DNA, sondern aus RNA bestand, veränderten den Lauf der Geschichte! Die HIV-1 Reverse Transkriptase ist bis heute die am besten untersuchte RT.
Aber was waren die Herausforderungen bei der Untersuchung von mRNA?
mRNA ist ein sehr instabiles Molekül und wird durch verschiedene Mechanismen abgebaut. Die Langlebigkeit der Proteinproduktion ist direkt proportional zur Stabilität der mRNAs. Diese begrenzte Lebensdauer der mRNA veranlasst die Zellen dazu, ihre Funktion je nach Bedarf zu verändern.
Mehrere Mechanismen für ihren Abbau sind:
- Ribonuklease-vermittelte Degradation:
Der prokaryotische mRNA-Abbau wird durch Ribonukleasen wie 3'- und 5'-Exonukleasen, RNase III und RNase J eingeleitet. - Eukaryotischer mRNA-Umsatz
In Eukaryoten erfolgt der Abbau durch Exosomenkomplex (auch in anderen Organismen vorhanden) und Entkappungskomplex.
Der Exosomenkomplex hat eine endoribonukleolytische Aktivität (nur bei Eukaryoten) und eine exoribonukleolytische Aktivität (bei Eukaryoten und anderen). - Zellulärer Protein-vermittelter Abbau
Einige zelluläre Proteine binden an den Poly-A-Schwanz (befindet sich bei 3’ UTR der mRNA) und destabilisieren das Transkript, was zu seinem Abbau führt. - Nonsense-vermittelter Zerfall
Transkripte mit premature Codons werden durch Entfernung des Poly-A-Schwanzes und endoribonukleolytische Spaltung abgebaut. - Kleine interferierende RNA (siRNA)
Diese siRNA vermittelt die mRNA-Spaltung über den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) in Metazoen. - MicroRNA (miRNA)
Sie binden an die mRNA und behindern die Translation. Sie helfen auch beim Abbau des Poly-A-Schwanzes. - Ununterbrochener Verfall
Die Transkripte sind auf Exosomenkomplex und -Abbau gerichtet, wenn das Ribosom durch den Poly-A-Schwanz translatiert, ohne auf ein Stoppcodon zu stoßen. - Piwi-interagierende RNA (piRNAs)
Diese RNAs kommen in Wirbeltieren und Wirbellosen gleichermaßen vor und regulieren das epigenetische und posttranskriptionale Silencing von Transposons.
Diese leicht abbaubare Natur macht unsere Zellen spontan, verärgert jedoch unsere Forscher, da RNA bei ex-vivo-Behandlung anfällig für Abbau ist.
Daher wurde RT-PCR als neuer Spieler im Spiel eingeführt.
Was ist eigentlich RT-PCR?
RT-PCR ist eine Technik zur Vervielfältigung der in der mRNA eines Organismus gespeicherten Information mit Hilfe eines Enzyms, der RNA-abhängigen DNA-Polymerase oder Reversen Transkriptase (RT), die zunächst die mRNA in cDNA umwandelt. Diese cDNA wird dann, wie bei der PCR, durch die DNA-Polymerase zu dsDNA vervielfältigt. Dies hat die wissenschaftliche Forschung reformiert, da diese DNA stabiler ist als RNA. Diese Technik hat es der Menschheit ermöglicht, schnelle und empfindliche RNA-Analysen durchzuführen, genau wie DNA-Analysen durch die PCR.
Wenn Sie sie kennen, kennen Sie sicher auch ihre Typen!
Als die Technik 1983 aufkam, ersetzte sie das Northern Blotting, das in großem Umfang zur Untersuchung der RNA-Expression verwendet wurde.
Northern Blotting war zeitaufwendig, erforderte eine große Menge an RNA und lieferte im Falle von weniger reichlich vorhandener RNA quantitativ ungenaue Daten.
Im Gegensatz dazu benötigt die RT-PCR weniger Ausgangsmaterial und ermöglichte die Untersuchung von fast jedem Transkript.
Zweistufige RT-PCR - Two step RT-PCR
Früher konnte die RT-PCR nur in 2 Schritten durchgeführt werden (die reverse Transkription erfolgte in einer separaten Reaktion).
Der erste war die reverse Transkription und der zweite die Real-Time PCR. Die reverse Transkription wurde zuerst mit einem anderen Puffer in einem anderen Röhrchen für die reverse Transkriptase durchgeführt und dann wurde ein Aliquot der im ersten Schritt hergestellten cDNA verwendet, um die real time PCR mit DNA-Polymerase mit einem anderen Puffer weiterzuführen (zwei Schritte). Dies ist eine recht arbeitsintensive und fehleranfällige Prozedur, zumal bei jedem Schritt Verunreinigungen durch den Transfer des Röhrcheninhalts von einem zum anderen eingeführt werden können. Auch das Öffnen und Schließen der Röhrchen ist eine potentielle Quelle für die Einführung von Verunreinigungen. Es war jedoch spezifischer und empfindlicher.
Für diejenigen, die eine cDNA-Bibliothek aufbauen wollen, ist die zweistufige RT-PCR eine ideale Wahl und GENAXXON hat das Kit dazu:
GENAXXON (M3134), Scriptase RT - cDNA Synthesis kit >
Unser Kit hat eine erhöhte thermische Stabilität und keine RNase H Aktivität, was zu einer höheren Effizienz, Full Length cDNA Synthese
und höherer Ausbeute führt.
Ein-Schritt-RT-PCR - One step RT-PCR
Heutzutage gibt es eine schnellere Version, bei der beide Schritte in einem kombiniert werden und das gesamte Experiment in einem Schritt durchgeführt werden kann (die reverse Transkription wird im gleichen Gefäß wie die PCR durchgeführt). In diesem Fall ist der Zeitaufwand deutlich geringer, und der Aufbau ist aufgrund der reduzierten Pipettierschritte viel einfacher. Auch das Kontaminationsrisiko ist sehr gering, da alle Reagenzien und Templates auf einmal eingebracht werden. Da der Puffer jedoch für die Arbeit der beiden Enzyme optimiert ist, ist die Methode nicht so empfindlich wie die zweistufige RT-PCR. Daher muss man alle Punkte berücksichtigen, bevor man sich für den Typ der RT-PCR entscheidet.
Diese Art der RT-PCR ist eine ideale Wahl, wenn das Zielgen, dessen Expressionsprofil untersucht werden soll, bereits bekannt ist.
Mit GENAXXON können Sie eine Ein-Schritt-RT-PCR auf verschiedene Arten durchführen. Unsere Ein-Schritt-RT-PCR-Kits basieren auf einer gentechnisch veränderten Reversen Transkriptase mit erhöhter thermischer Stabilität, was zu einer erhöhten Spezifität, einer hohen cDNA-Ausbeute und einer verbesserten Effizienz für hochstrukturierte und lange cDNA-Fragmente führt. Unsere Hot-Start-DNA-Polymerase hilft bei der Bekämpfung von Fehlpaarungen der Primer, Sekundärstrukturbildung, Primer-Dimeren und Hintergrundverschmutzung.
1) M3068: Genaxxon hat zunächst ein Kit entwickelt, das aus einem Röhrchen mit Puffermischung und Primern und einem weiteren Röhrchen mit Enzymmischung besteht.
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Unser Kit basiert auf einem anderen Farbstoff als der SYBR® Green Fluoreszenzfarbstoff und ist im Vergleich zu den SYBR® Green basierten one step RT-PCR Kits weniger anfällig für PCR-Inhibition. One-Step RT-qPCR 2X GreenMastermix >
4) M3138: uantitative Echtzeit-RT-PCR mit
GENAXXON One-Step RT-qPCR 2X ProbeMastermix >
Der One-Step RT-qPCR 2X ProbeMastermix ohne ROX® wurde für die quantitative Echtzeitanalyse von RNA-Templates mit doppelt markierten Fluoreszenzsonden entwickelt.
Nachdem wir nun so viel über RT-PCR gesprochen haben, was sind ihre Anwendungen?
Rt-PCR wurde ausgiebig für die Erstellung von Genexpressionsprofilen/Transkriptomanalysen verwendet. Bei dieser Methode wird die Expression von Genen unter
bestimmten Bedingungen über Heatmaps bestimmt.
Dies wird für Tausende von Genen oder das gesamte Genom auf einmal durchgeführt. Damit lässt sich feststellen, welche Funktion die Zelle unter diesen Bedingungen ausführt.
Dies wird untersucht, da immer noch nicht vollständig verstanden ist, wie ein Genom verschiedene Zelltypen hervorbringen kann und welche Regulationsmechanismen dahinter stehen.
Zwei Haupttypen von Techniken, die für die Transkriptomanalyse verwendet werden, sind:
cDNA microarray / cDNA library
Picomole von Oligomersonden werden auf einer festen Oberfläche (Chip) angeordnet. Auf diese Chips werden dann fluoreszenzmarkierte Transkripte aufgebracht. Die Fluoreszenzintensität, die durch die Hybridisierung der Transkripte mit ihren komplementären Oligomeren an einer bestimmten Sondenposition erzeugt wird, impliziert die Abundanz der Transkripte für diese Sonde.
RNA-Sequenzierung
Auch als RNA-Seq abgekürzt, verwendet diese Technik Next Generation Sequencing, um Informationen über das exprimierte Gen abzuleiten. Dies hilft, im Laufe der Zeit Änderungen im Expressionsprofil, SNPs, posttranskriptionelle Modifikationen, verschiedene Spleißvarianten usw. zu bestimmen. Diese Technik gewinnt immer mehr an Popularität und überholt das DNA-Microarray-basierte Genprofiling. Ein gutes Beispiel dafür ist die scRNA-Seq, die hilft, neue Zelltypen innerhalb einer heterogenen Zellpopulation zu identifizieren.
Andere
Weitere Techniken sind die ESTs (Expressed Sequenced Tags), die zum Design der Microarray-Sonden verwendet werden und SAGE (Serial analysis of gene expression)/CAGE (cap analysis of gene expression). SAGE/CAGE wurden für die Quantifizierung und Hochdurchsatz-Generierung von ESTs erfunden. Aufgrund ihrer aufwendigen Probenvorbereitung und Datenanalyse werden sie jedoch nur selten eingesetzt.
Obwohl das Genexpressionsprofil uns unschätzbare Einblicke in die zelluläre Funktionsweise gibt, legt es nicht den gesamten Regulationsmechanismus offen, da die Genregulation auch auf posttranskriptioneller Ebene stattfindet.