genaxxon-blog-agarose
1. Oktober 2021
Science
Agarosen - für jede Anwendung eine Lösung von GENAXXON
Ob Standardagarose, hochauflösende Agarose oder low-melting Agarose – die Wahl der richtigen Agarose im Labor hängt von der Größe der DNA- oder RNA-Fragmente ab, die Sie trennen möchten, sowie von den geplanten Anwendungen. Ob Blotting, PFGE, In-Gel-Analysen, Plaque-Assays oder Immundiffusion – Genaxxon bietet für jede Anwendung die passende Lösung.
Sie möchten die ideale Agarose für Ihre Experimente finden und zusätzlich wertvolle Tipps erhalten? Dann lesen Sie weiter!
Welche Agarose ist die richtige für Ihre Anwendung?
Genaxxon bietet Ihnen eine breite Auswahl an hochwertigen Agarosen, die sich durch einen niedrigen Sulfatgehalt und einen geringen EEO-Wert (Elektroendosmose) auszeichnen. Sie sind universell einsetzbar in allen Gel-Puffersystemen und selbstverständlich frei von DNasen und RNasen.
Noch unsicher, welche Agarose optimal zu Ihrem Experiment passt? Unsere Tabelle sowie Selection Chart weiter unten helfen Ihnen dabei, die perfekte Wahl für Ihre Anwendung zu treffen:
Agarose-Gelelektrophorese: Ein Überblick für die Praxis
Die Herstellung eines Agarosegels beginnt mit dem Lösen der Agarose in einem Elektrophoresepuffer (TAE oder TBE). Beim Abkühlen bildet sich ein Gel, dessen Porengröße direkt von der Agarosekonzentration abhängt. Je höher die Konzentration, desto kleiner werden die Poren, und das Gel wird fester. Diese Eigenschaft beeinflusst die Trennung der Moleküle – größere DNA-Fragmente werden stärker im Gel zurückgehalten als kleinere.
Das Prinzip der Gelelektrophorese
Im elektrischen Feld wandern die negativ geladenen DNA-Moleküle durch die Poren des Gels in Richtung des Pluspols. Kleinere Moleküle passieren die Poren schneller als größere, wodurch die Trennung nach Größe erfolgt.
Sichtbarmachung und Dokumentation
Fluoreszierende Farbstoffe wie SafeGel ersetzen das toxische Ethidiumbromid, um die DNA-Banden sichtbar zu machen. Die Analyse der DNA-Banden erfolgt mit einer DNA-Leiter als Referenz für Größe und Konzentration.
Einflussfaktoren: Agarose und Puffer
Neben der Agarose-Konzentration können auch geladene Gruppen der Agarose und der verwendete Elektrophoresepuffer die Auftrennung der DNA-Moleküle beeinflussen:
- die geladenen Gruppen der Agarose (Pyruvat- und Sulfat-Gruppen) bestimmen die Elektroendosmose (EEO-Wert)
- die negativen Sulfationen sind an die Gelmatrix gebunden, die Kationen (K+, Na+) sind dagegen frei beweglich. Bei der Elektrophorese wandern beide Gruppen gegeneinander, was einen unerwünschten Bremseffekt ergibt. Daraus folgt: bei einem hohen EEO-Wert (zB hoher Sulfatgehalt der Agarose) wandert die DNA langsamer und die Banden können unscharf werden.
- TAE-Puffer: hat eine geringe Ionenstärke und eine geringe Pufferkapazität. Wird für die Auftrennung größerer DNA-Moleküle (ab 1kb) empfohlen und wenn die aufgetrennte DNA wieder isoliert werden soll.
- TBE-Puffer: hat eine hohe Ionenstärke und hohe Pufferkapazität. Bildet schärfere Banden bei kleinen DNA-Molekülen und ist daher für die Auftrennung kleiner DNA-Moleküle (<1kb) zu empfehlen.
GENAXXON bietet Ihnen für die gelelektrophoretische Auftrennung ihrer DNA-Moleküle folgende Agarosen:
1. Hoch-auflösende Agarosen
- Es können Unterschiede von wenigen Basen (2-3bp) sichtbar gemacht werden
- Es sind Gele bis 4% möglich • Hoch auflösende Agarosen können mit anderen Agarosen gemischt werden
- Durch eine stufenweise Beimischung der Agarose Tiny (M3046) zur Agarose LE (M3044) können die Trenneigenschaften und die Auflösung der Agarose LE deutlich verbessert werden
- Agarose Tiny (M3046) kann Polyacrylamid-Gele ersetzen
- Allel-sizing Experimente
- zur Bestimmung von Mikrosatelliten - auch bezeichnet als Short-Tandem-Repeats (CTR)
- bei der Mutationsanalyse - zB zum Nachweis kleiner Deletionen oder Insertionen
Die Schmelz- und Geliertemperaturen von Agarosen können zum Bsp. durch chemische Modifikationen beeinflusst werden. Dabei wird zumeist die Zahl der Wasserstoffbrücken reduziert, die für die Quervernetzungen der gewundenen Polysaccharid-Ketten der Agarose verantwortlich sind. Durch den Grad der Modifikationen kann somit direkt auf die Schmelz- und Geliertemperatur der Agarose Einfluss genommen werden.
Besondere Eigenschaften der low-melting-Agarosen:
- bilden Gele mit höherer Transparenz im Vergleich zur Standardagarose
- durch niedrigen Schmelzpunkt speziell für die schnelle Extraktion von DNA aus Gelen geeignet
- geeignet für "in-gel" Bearbeitung der DNA mit Enzymen
- gut geeignet für die DNA und RNA Re-Isolation aus Gelen mit Hilfe eines Gel-Extraktionskits
- für den Verdau mit ß-Agarase geeignet
- große DNA-Fragmente können dadurch besonders schonend isoliert werden
- für Zell und Gewebekultur geeignet (M3049 - Agarose LM - low melting)
- für Phage-Plaque Assays geeignet
GENAXXON bietet Ihnen zwei "low-melting" Agarosen zur Auswahl an:
Anwendungen der GENAXXON Agarosen
1. Blotting (Southern Blot)
Die zu untersuchende DNA wird zunächst durch Restriktionsenzyme verdaut und danach über eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt.
Durch Zugabe von Alkalien wird die aufgetrennte DNA in Einzelstränge aufgespalten, bevor sie auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen wird (Blotten).
Danach werden zumeist markierte RNA-Sonden zugegeben, die zur gesuchten Sequenz komplementär sind. Befindet sich die gesuchte Sequenz auf der Membran, dann bindet die Sonde an diese Sequenz (Hybridisierung) und kann anschließend je nach Markierung detektiert werden.
Folgende Agarosen von Genaxxon sind für Blotting-Experimente geeignet:
- M3044 - Agarose LE- Standardagarose
- M3054 - Agarose LE Tabletten
- M3047 - Agarose Tiny HT
- M3051 - Agarose Mega
2. PFGE (Pulsed-Field-Gelelektrophorese)
PFGE ist eine Methode zur Längenbestimmung von DNA-Fragmenten chromosomaler Größe (30-50kb), zur Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks, zur Typisierung bakterieller Genome oder zur Identifikation von Pathogenen.
Der Unterschied zur normalen Agarose-Gelelektrophorese besteht darin, dass kein zeitlich homogenes Feld angelegt wird, sondern periodisch für kurze Zeit umgepolt wird. Dadurch wird die Auflösung im Bereich zwischen 30kb und 50kb deutlich verbessert und steht für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Auch für die PFGE bietet Ihnen GENAXXON eine geeignete Agarose:
3. Phage-Plaque Assay
Ein Plaque-Assay ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen Viren.
Für Zellkultur: ein Zellrasen wird mit Agarose überschichtet, die den zu testenden Virus in unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Nach Inkubation wird die Agarose abgekratzt und die Zellen eingefärbt. Die Virenplaques sind als durchsichtige Flecken zu erkennen.
Für Bakterienkulturen: sensitive Bakterien werden mit Agarose vermischt und damit eine Vollmedium-Platte überschichtet. Anschließend werden die zu testenden Viren (Phagen) in verschiedenen Konzentrationen aufgetropft. Nach Inkubation können die Phagen-Plaques als durchsichtige Flecken im Bakterienrasen ausgewertet werden.
Für den Phage-Plaque Assay empfiehlt Ihnen GENAXXON folgende Agarose:
4. Immundiffusion
Der Immundiffusionstest ist ein einfaches immun-chemisches Verfahren zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Eines der bekanntesten Verfahren ist der sogenannte Ouchterlony-Test. Dabei wird eine Glasplatte zuerst mit einem Agarose-Gel beschichtet. Danach werden in vorgestanzte Löcher Antigene und Antikörper pipettiert, die aufeinander zu diffundieren. Ringförmige Präzipitationslinien bilden sich dort, wo Antigen und Antikörper in äquivalenter Konzentration aufeinandertreffen.
Für die Immundiffusion eignet sich folgende Agarose von GENAXXON:
Zugehörige Produkte
