Agarosen - für jede Anwendung eine Lösung von GENAXXON

Ob Sie im Labor eine Standardagarose, eine hochauflösende Agarose oder eine low-melting Agarose benötigen, hängt davon ab, welche Größen die DNA- oder RNA-Fragmente haben die Sie elektrophoretisch Auftrennen möchten, oder ob weitere analytische Methoden wie Blotting, PFGE, In-Gel Anwendungen, Plaque-Assays oder Immundiffusion verwendet werden sollen.

Egal welche Methode zum Einsatz kommt - Genaxxon bietet Ihnen für jede Anwendung die richtige Agarose.

Sie sind daran interessiert, die perfekte Agarose für Ihre Anwendung zu finden und darüber hinaus noch nützliche Tipps zu bekommen - dann lesen Sie weiter.

Welche Agarose passt optimal zu welcher Anwendung?

Genaxxon bietet ihnen eine Vielzahl verschiedener Agarosen für alle ihre Anwendungen. Alle Agarosen haben einen niedrigen Sulfatgehalt und einen niedrigen EEO-Wert (Elektroendosmose). Zudem können alle Agarosen in allen Gel-Puffersystemen verwendet werden und sind natürlich DNase- und RNase-frei.

Sie sind noch unsicher, welche Agarose für Ihre Anwendung am Besten passt?
Die nachfolgende Tabelle (1) bietet Ihnen die einfache Möglichkeit, die richtige Agarose zur gewünschten Anwendung auszuwählen:

Tab. 1:  Agarosen von Genaxxon - für jede Anwendung eine Lösung

Properties / 
Applications 
AGAROSE
LE Standardagarose 
M3044
LE Tabletten
M3054 
Tiny 
M3046
Tiny HT 
M3047
Tiny HTM 
M3040
LM low-melting 
M3049
Mega
M3051
Melting point Standard Standard Low Standard Standard Low Standard
Gel Strength High High Low High High Low High
Separation Range
0 bis 1,5kb
    X X X    
Separation Range
50bp bis 50kb
X X       X X
High resolution
Differences of
2-3bp visible
    X X X    
Low-Melting     X     X  
Genotyping X X X X     X
Mutation analysis     X X      
Allele sizing     X X      
Short tandem
repeats
    X X      
Blotting X X   X X   X
PFGE             X
In-Gel applications     X     X  
Cell- and tissue
culture
          X  
Phage-Plaque Assay           X  
Immundiffusion X X         X

 

Wissenswertes zur Agarose

Agarose ist ein Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose, die glycosidisch miteinander verbunden sind. Agarose stellt die Hauptkomponente des Agars dar und wird vor allem aus den Rotalgengattungen Gelidium und Gracillaria gewonnen. Agarose ist ein starker Gelbildner und für die Gelierfähigkeit des Agars verantwortlich, enthält jedoch weniger negative Ladungen als der Agar.
Die Aufreinigung der Agarose erfolgt nach Kettenlänge, Sulfatgehalt und Methylierungsgrad. Die gewundenen Polysaccharid-Ketten sind durch Wasserstoffbrücken quervernetzt und bilden eine maschendrahtähnliche, makroporöse Matrix, deren Porengröße zwischen 100 und 300 nm variiert.

Wichitge Fakten zur Agarose

  • Agarose ist ein weißliches, nichttoxisches Pulver, das aus Algen isoliert wird
  • Agarosen haben verschiedene Schmelz- und Geliertemperaturen (zum Bsp. "low-melting"), die auf die verschiedene Anwendungen optimiert sind
  • Die Geliertemperatur wird vom Methylierungsgrad (natürlich oder synthetisch) der Agarose bestimmt
  • Geladene Gruppen der Agarose (Pyruvat- und Sulfatgruppen) bestimmen den EEO-Wert (Elektroendosmose)
  • Agarosen haben verschiedene Gelstärken, die in Gramm pro Quadratzentimeter angegeben werden und von der Art und der Konzentration der Agarose abhängen

 

Doch schauen wir jetzt einmal genauer auf die verschiedenen Anwendungen der Agarosen

 

1. Elektrophoretische Auftrennung von Biomolekülen (Elektrophorese)

Die abgewogene Agarose wird durch Aufkochen in Elektrophoresepuffer TAE-Puffer (M3085, M3087) oder TBE-Puffer (M3088, M3206) gelöst.
Durch Abkühlen bildet sich durch Quervernetzung ein Gel der Agarose, dessen Porengröße sich nach der Agarosekonzentration richtet.
Eine Faustformel sagt: je höher die Agarosekonzentration, desto kleiner sind die Poren und desto fester ist das Gel.

Eine Vereinfachung bei der Herstellung Ihrer Gele bieten Ihnen unsere Agarose LE - Tabletten (M3054).
Jede Tablette enthält 0,5g Agarose LE und ist einfach in TAE- oder TBE-Puffer zu lösen. Da das Abwiegen entfällt, kommt es im Labor zu keiner Staubentwicklung mehr (Schutz vor Kontamination).

Eine kleine Hilfe bei der Überlegung welche Agarose-Konzentration für welchen Trennbereich empfohlen wird, gibt die nachfolgende Tabelle (2)
am Beispiel der Standardagarose LE (aus: https://de.wikipedia.org/wiki/Agarose).

Tab. 2:  Welche Agarose-Konzentration wird für welchen Trennbereich empfohlen:

Agarose-Konzentration in % (w/v) 

Trennbereich in bp  

AGAROSES offered by Genaxxon

 
 
 
 
 
 

0,5 

1000–50000  

0,7 

800–12000  

1,0 

500–10000  

1,2 

400–7000  

1,4 

200–4000  

2,0 

50–2000  

 

Vor dem Auftragen der Proben auf das Agarosegel werden die aufzutrennenden PCR-Produkte (zum Bsp. nach einer Genotypisierung), Plasmide (Plasmid-Isolierungs-Kits: S5364, S5365, S5369) oder DNA-Fragmente nach einem Restriktionsverdau noch mit einem DNA-Ladepuffer (M3308, M3309, M3321) und evtl. zur Verdünnung mit Nuklease und DNA-freiem Wasser (M6340) vermischt.

Die Gelelektrophorese selbst funktioniert wie ein Sieb für Moleküle, bei dem größere Moleküle stärker im Gel zurückgehalten werden als Kleinere. Legt man ein elektrisches Feld an, werden die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle in Richtung des Pluspols durch die Gelporen gezogen, wodurch eine Auftrennung nach ihrer Größe erfolgt.

Zur Sichtbarmachung der aufgetrennten DNA-Moleküle wird dem Gel zumeist ein in die DNA interkalierender Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt. Früher wurde hierzu der toxische Farbstoff Ethidiumbromid (M3179) verwendet, der heutzutage glücklicherweise durch nicht-toxische Fluoreszenzfarbstoffe wie GelRed (M3199) ersetzt wurde. Die aufgetrennten Banden im Agarosegel können dann durch UV-Licht sichtbar gemacht und dokumentiert werden.
Die Abschätzung der Größe und der Konzentration der erhaltenen DNA-Banden erfolgt anhand einer DNA-Leiter (50bp-Leiter (M3072), 100bp-Leiter (M3094), 1kb-Leiter (M3328)).

Neben der Agarose-Konzentration können auch geladene Gruppen der Agarose und der verwendete Elektrophoresepuffer die Auftrennung der DNA-Moleküle beeinflussen:

  • die geladenen Gruppen der Agarose (Pyruvat- und Sulfat-Gruppen) bestimmen die Elektroendosmose (EEO-Wert)
  • die negativen Sulfationen sind an die Gelmatrix gebunden, die Kationen (K+, Na+) sind dagegen frei beweglich. Bei der Elektrophorese wandern beide Gruppen gegeneinander, was einen unerwünschten Bremseffekt ergibt.
    Daraus folgt: bei einem hohen EEO-Wert (zB hoher Sulfatgehalt der Agarose) wandert die DNA langsamer und die Banden können unscharf werden.
  • TAE-Puffer (M3085, M3087): hat eine geringe Ionenstärke und eine geringe Pufferkapazität. Wird für die Auftrennung größerer DNA-Moleküle (ab 1kb) empfohlen und wenn die aufgetrennte DNA wieder isoliert werden soll.
  • TBE-Puffer (M3088, M3206): hat eine hohe Ionenstärke und hohe Pufferkapazität. Bildet schärfere Banden bei kleinen DNA-Molekülen und ist daher für die Auftrennung kleiner DNA-Moleküle (<1kb) zu empfehlen.


GENAXXON bietet Ihnen für die gelelektrophoretische Auftrennung ihrer DNA-Moleküle folgende Agarosen:

Trennbereich von 0 bis 1,5kb (Agarosen mit hoher Auflösung, Unterschiede von 2-3 bp sind sichtbar)

  • M3046 - Agarose Tiny (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten auf Homepage)
  • M3047 - Agarose Tiny HT (Eigenschaften der Agarose)
  • M3040 - Agarose Tiny HTM (Eigenschaften der Agarose)


Trennbereich von 50bp bis 50kb

  • M3044 - Agarose LE- Standardagarose (Eigenschaften der Agarose)
  • M3054 - Agarose LE Tabletten (Eigenschaften der Agarose)
  • M3049 - Agarose LM - low melting (Eigenschaften der Agarose)
  • M3051 - Agarose Mega (Eigenschaften der Agarose)


2. Einige Besonderheiten der hoch auflösenden Agarosen

  • Es können Unterschiede von wenigen Basen (2-3bp) sichtbar gemacht werden
  • Es sind Gele bis 4% möglich
  • Hoch auflösende Agarosen können mit anderen Agarosen gemischt werden
  • Durch eine stufenweise Beimischung der Agarose Tiny (M3046) zur Agarose LE (M3044) können die Trenneigenschaften und die Auflösung der Agarose LE deutlich verbessert werden
  • Agarose Tiny (M3046) kann Polyacrylamid-Gele ersetzen
  • Die Agarosen Tiny (M3046) und die Tiny HT (M3047) können zudem eingesetzt werden für:
  • Allel-sizing Experimente
  • zur Bestimmung von Mikrosatelliten - auch bezeichnet als Short-Tandem-Repeats (CTR)
  • bei der Mutationsanalyse - zB zum Nachweis kleiner Deletionen oder Insertionen


Genaxxon bietet Ihnen mehrere hochauflösende Agarosen an:

  • M3046 - Agarose Tiny (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)
  • M3047 - Agarose Tiny HT (Eigenschaften der Agarose)
  • M3040 - Agarose Tiny HTM (Eigenschaften der Agarose)

 

3. Low-melting-Agarosen

Die Schmelz- und Geliertemperaturen von Agarosen können zum Bsp. durch chemische Modifikationen beeinflusst werden. Dabei wird zumeist die Zahl der Wasserstoffbrücken reduziert, die für die Quervernetzungen der gewundenen Polysaccharid-Ketten der Agarose verantwortlich sind. Durch den Grad der Modifikationen kann somit direkt auf die Schmelz- und Geliertemperatur der Agarose Einfluss genommen werden.

Besondere Eigenschaften der low-melting-Agarosen

  • bilden Gele mit höherer Transparenz im Vergleich zur Standardagarose
  • durch niedrigen Schmelzpunkt speziell für die schnelle Extraktion von DNA aus Gelen geeignet
  • geeignet für "in-gel" Bearbeitung der DNA mit Enzymen
  • gut geeignet für die DNA und RNA Re-Isolation aus Gelen mit Hilfe eines Gel-Extraktionskits (S5303, S5308, S5374)
  • für den Verdau mit ß-Agarase (S5223) geeignet
  • große DNA-Fragmente können dadurch besonders schonend isoliert werden
  • für Zell und Gewebekultur geeignet (M3049 - Agarose LM - low melting)
  • für Phage-Plaque Assays geeignet
  • Agarose Tiny (M3046) kann als Ersatz für Polyacrylamidgele verwendet werden


GENAXXON bietet Ihnen zwei "low-melting" Agarosen zur Auswahl an:

  • M3046 - Agarose Tiny (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)
  • M3049 - Agarose LM - low melting (Eigenschaften der Agarose)


4. Blotting (Southern Blot)

Die zu untersuchende DNA wird zunächst durch Restriktionsenzyme verdaut und danach über eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt.
Durch Zugabe von Alkalien wird die aufgetrennte DNA in Einzelstränge aufgespalten, bevor sie auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen wird (Blotten).
Danach werden zumeist markierte RNA-Sonden zugegeben, die zur gesuchten Sequenz komplementär sind. Befindet sich die gesuchte Sequenz auf der Membran, dann bindet die Sonde an diese Sequenz (Hybridisierung) und kann anschließend je nach Markierung detektiert werden.

Folgende Agarosen von Genaxxon sind für Blotting-Experimente geeignet:

  • M3044 - Agarose LE- Standardagarose (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)
  • M3054 - Agarose LE Tabletten (Eigenschaften der Agarose)
  • M3047 - Agarose Tiny HT (Eigenschaften der Agarose)
  • M3040 - Agarose Tiny HTM (Eigenschaften der Agarose)
  • M3051 - Agarose Mega (Eigenschaften der Agarose)


5. PFGE (Pulsed-Field-Gelelektrophorese)

PFGE ist eine Methode zur Längenbestimmung von DNA-Fragmenten chromosomaler Größe (30-50kb), zur Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks, zur Typisierung bakterieller Genome oder zur Identifikation von Pathogenen.
Der Unterschied zur normalen Agarose-Gelelektrophorese besteht darin, dass kein zeitlich homogenes Feld angelegt wird, sondern periodisch für kurze Zeit umgepolt wird. Dadurch wird die Auflösung im Bereich zwischen 30kb und 50kb deutlich verbessert und steht für weitere Untersuchungen zur Verfügung.

Auch für die PFGE bietet Ihnen GENAXXON eine geeignete Agarose:

M3051 - Agarose Mega (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)


6. Phage-Plaque Assay

Ein Plaque-Assay ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen Viren.

  • Für Zellkultur: ein Zellrasen wird mit Agarose überschichtet, die den zu testenden Virus in unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Nach Inkubation wird die Agarose abgekratzt und die Zellen eingefärbt. Die Virenplaques sind als durchsichtige Flecken zu erkennen.
  • Für Bakterienkulturen: sensitive Bakterien werden mit Agarose vermischt und damit eine Vollmedium-Platte überschichtet. Anschließend werden die zu testenden Viren (Phagen) in verschiedenen Konzentrationen aufgetropft. Nach Inkubation können die Phagen-Plaques als durchsichtige Flecken im Bakterienrasen ausgewertet werden.


Für den Phage-Plaque Assay empfiehlt Ihnen GENAXXON folgende Agarose:

M3049 - Agarose LM - low melting (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)


7. Immundiffusion

Der Immundiffusionstest ist ein einfaches immun-chemisches Verfahren zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Eines der bekanntesten Verfahren ist der sogenannte Ouchterlony-Test. Dabei wird eine Glasplatte zuerst mit einem Agarose-Gel beschichtet. Danach werden in vorgestanzte Löcher Antigene und Antikörper pipettiert, die aufeinander zu diffundieren. Ringförmige Präzipitationslinien bilden sich dort, wo Antigen und Antikörper in äquivalenter Konzentration aufeinandertreffen.

Für die Immundiffusion eignet sich folgende Agarose von GENAXXON:
M3051 - Agarose Mega (Eigenschaften der Agarose = Link zu technischen Daten)

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